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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 离子交换层析求助
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Biochemical

铜虫 (初入文坛)

[求助] 离子交换层析求助

酯酶的分离纯化，酯酶来源于摩式摩根菌，采用的是传统的纯化策略。目前遇到了一个比较棘手的问题就是过柱子的时候挂不上去，阴离子DEAE,HIGH Q，缓冲液是TIS-HCI pH=8.5，结果都是活力大部分都在穿透峰。阳离子的是CM，缓冲液醋酸和醋酸钠pH=5.4，结果也是一样，活力也大部分在穿透。疏水柱：丁基 用了2M硫酸铵，也没有结合。
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1楼 2012-03-14 15:27:02
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

liudt1105

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个一般是不知道等电点才发生的情况。。。。如果真是等电点不知道，建议你按照三楼说的试试摸索一下。
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安琪酵母浸粉、蛋白胨，您实验的好助手
5楼2012-03-14 23:52:25
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lzgxgz

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的发酵液是怎么处理的？是否有高离子强度？
我看到你说大部分透过，意思应该有部分结合
我以为有两种情况：过载或离子强度太大，建议上离子交换柱前先透析。
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6楼2012-03-15 05:56:36
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普通回帖

果断悉尼

铁杆木虫 (知名作家)

三沙市名誉常务副市长

优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking(金币+3): 鼓励发帖交流！ 2012-03-14 18:12:38
非专业人士给点建议
1、可否考虑改变上样缓冲液的PH
2、可否考虑把穿透处理下 再去过一次柱子 这个时候或许竞争结合的杂质少了 目的蛋白的结合活性就强了
3、上样的样品可否处理下 比如盐析 除去大部分的其他杂蛋白等
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我的微信号happyjk5208，谢绝闲聊
2楼2012-03-14 15:44:44
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jianqiangsui

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不知道你要分离的目的蛋白等电点是多少？在不知道等电点的情况下，建议你先用强阴或强阳离子交换剂探索纯化条件，先改变洗脱液的pH，洗脱液的浓度应尽量小
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学海无涯
3楼2012-03-14 17:02:43
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lihuan0525

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用离子交换，一个非常重要的因素就是你一定要知道目标蛋白的等电点，要不你摸索条件很困难的。
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4楼2012-03-14 22:38:45
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yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议用硫铵分级沉淀后透析在上阴离子，不知道在过柱子时是否电导发生很大变化？柱子是自装还是预装，最好再生一下用。可能柱效不行了。阴离子缓冲液可以50mM TIS-HCI pH=7.2上个强阴离子柱先试一下，再过凝胶柱。
祝你好运。
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7楼2012-03-15 08:52:13
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乐菲鱼

金虫 (著名写手)
学习 也在用柱
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8楼2012-03-15 09:12:42
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Biochemical

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by 果断悉尼 at 2012-03-14 15:44:44:
非专业人士给点建议
1、可否考虑改变上样缓冲液的PH
2、可否考虑把穿透处理下 再去过一次柱子 这个时候或许竞争结合的杂质少了 目的蛋白的结合活性就强了
3、上样的样品可否处理下 比如盐析 除去大部分的其他杂 ...

谢谢啊
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9楼2012-03-15 10:50:46
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Biochemical

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by jianqiangsui at 2012-03-14 17:02:43:
不知道你要分离的目的蛋白等电点是多少？在不知道等电点的情况下，建议你先用强阴或强阳离子交换剂探索纯化条件，先改变洗脱液的pH，洗脱液的浓度应尽量小

嗯 ，目前蛋白的等电点还不知道，阳离子也试过一次是CM柱，用的缓存液是pH=5.4的，目前想再降低缓冲液的pH，再试试
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10楼2012-03-15 10:53:08
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