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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】离子交换层析
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泡泡9706

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】离子交换层析 已有4人参与

我异源表达的目的蛋白等电点预测为9，粗酶液上阴离子交换柱，用ph 7.5的缓冲液，目的蛋白在穿透峰里。我想换用阳离子交换柱，可是用了20mM ph 5的醋酸缓冲液，ph 7的磷酸缓冲液，所有的蛋白都不挂柱，都在穿透峰里，试了好多柱子，强阳的，弱阳的，预装的，自己装的，都是这个情况，想请教高手，会是什么原因呢？
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1楼 2010-04-28 18:57:10
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your2007

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
lstt09nk(金币+2): 2010-04-28 20:21
泡泡9706(金币+1): 2010-04-29 14:11
建议你还是用阳柱，除非你的酶最适pH比9还要高，那就可以用阴柱，其实这个还是要靠摸索的，别人提供的不一定可行。
PS ：不知道你的蛋白表达量如何，柱子性能如何，梯度洗脱条件如何，既然有填料，你可以用小管先做预实验，不要灰心（觉得你也没有做太多尝试）祝好！
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2楼2010-04-28 19:46:32
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月月大可

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
泡泡9706(金币+1): 2010-04-29 14:15
scelab(金币+3):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-30 15:52
偶的蛋白预测PI为8.8-9.0，最初的时候高聚不挂柱，后来想办法解聚了。在pH6.5的MES中挂在Resource S柱上，纯化的效果还是不错的。
考虑你的蛋白是不是也是高聚状态，如果是的话不挂柱也正常了。有几个半胱氨酸？有的话要加入β-巯基乙醇或者DTT，防止形成错误的二硫键；是否结合底物会有较强的构象改变，如果是可以考虑加入底物，稳定结构。

多对你蛋白的性质进行了解，然后尝试。

有填料建议使用小柱子做预实验。
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3楼2010-04-29 12:15:32
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泡泡9706

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by your2007 at 2010-04-28 19:46:32:
建议你还是用阳柱，除非你的酶最适pH比9还要高，那就可以用阴柱，其实这个还是要靠摸索的，别人提供的不一定可行。
PS ：不知道你的蛋白表达量如何，柱子性能如何，梯度洗脱条件如何，既然有填料，你可以用小管先 ...

谢谢！我的酶最适ph在酸性，表达量不高，不带标签。我很奇怪的是，我的酶液中杂蛋白很多，目的蛋白很少，但是上阳离子柱的话，ph都降到5了，还是所有的蛋白都不挂柱，是操作的时候要注意什么问题吗？我上的样是硫酸铵沉淀以后，透析过的。
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4楼2010-04-29 14:13:48
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泡泡9706

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2010-04-29 12:15:32:
偶的蛋白预测PI为8.8-9.0，最初的时候高聚不挂柱，后来想办法解聚了。在pH6.5的MES中挂在Resource S柱上，纯化的效果还是不错的。
考虑你的蛋白是不是也是高聚状态，如果是的话不挂柱也正常了。有几个半胱氨酸？ ...

谢谢！
我的最大问题是所有的蛋白包括杂蛋白都不挂柱，实在是摸不着头脑。
我的蛋白是单体，高聚是什么意思呢？
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5楼2010-04-29 14:17:05
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your2007

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★
泡泡9706(金币+2): 2010-04-30 14:53
scelab(金币+3):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-30 15:52
引用回帖:
Originally posted by 泡泡9706 at 2010-04-29 14:13:48:


谢谢！我的酶最适ph在酸性，表达量不高，不带标签。我很奇怪的是，我的酶液中杂蛋白很多，目的蛋白很少，但是上阳离子柱的话，ph都降到5了，还是所有的蛋白都不挂柱，是操作的时候要注意什么问题吗？我上的样 ...

你说的这种情况我还没有遇到过，再怎么样不至于杂蛋白也挂不住吧，你先要排除掉柱子本身没有问题，如果这个有问题那就没辙了，如果没有问题的话，看来你要尝试另外的纯化途径了。目的蛋白大小应该是已知的了，你看能不能先凝胶过滤一下，再尝试一下。
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6楼2010-04-29 15:30:33
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月月大可

木虫 (著名写手)
★
泡泡9706(金币+1): 2010-04-30 14:51
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-30 15:53
杂蛋白不挂柱也是一种比较正常的现象，绝大多数的蛋白是酸性蛋白，更加适合挂阴离子柱。
呵呵，你尝试一下不用硫酸铵沉淀直接挂柱子试试。

你如何知道在异源表达后的蛋白还是单体？

我说的蛋白高聚就是指多个蛋白分子聚合在一起，形成一个较大的集团。
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7楼2010-04-30 12:29:33
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泡泡9706

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2010-04-30 12:29:33:
杂蛋白不挂柱也是一种比较正常的现象，绝大多数的蛋白是酸性蛋白，更加适合挂阴离子柱。
呵呵，你尝试一下不用硫酸铵沉淀直接挂柱子试试。

你如何知道在异源表达后的蛋白还是单体？

我说的蛋白高聚就是指多 ...

如果是高聚体的话，那还有酶活吗？我的蛋白是有酶活的呢。
不硫胺沉淀直接过柱子我也试过，也是这个样子
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8楼2010-04-30 14:53:27
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泡泡9706

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by your2007 at 2010-04-29 15:30:33:

你说的这种情况我还没有遇到过，再怎么样不至于杂蛋白也挂不住吧，你先要排除掉柱子本身没有问题，如果这个有问题那就没辙了，如果没有问题的话，看来你要尝试另外的纯化途径了。目的蛋白大小应该是已知的了，你 ...

我也觉得挺不可思议的。那我就再尝试吧！多谢指导！
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9楼2010-04-30 14:54:17
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guoenwen

金虫 (小有名气)
不知道你的上样Buffer是什么啊？看一下是不是盐太高了。
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10楼2010-05-02 09:19:41
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