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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】蛋白质的阴离子交换纯化
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wqf@126.com

银虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】蛋白质的阴离子交换纯化 已有12人参与

各位大侠：
      
        我做的蛋白等电点是4.3，用PH=7.4的PBS缓冲液作为A液来平衡柱子，该缓冲液不含NaCl，结果出乎意料的是我的蛋白质竟然不能结合到柱子上去，而直接从柱子里穿透出来，这是为什么呢？
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1楼 2011-03-07 14:42:59
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微笑漩涡

新虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你的蛋白对NaCl敏感么？ 离子强度不够，蛋白挂不上去吧？
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2楼2011-03-07 15:52:10
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wqf@126.com

银虫 (正式写手)
应该不是因为这个原因，在做离子交换之前我加热处理了我的蛋白，不知道加热对它会不会有影响？
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3楼2011-03-07 16:13:53
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lcy1971

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
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rainwander(金币+2): 鼓励新虫 2011-03-07 19:54:02
离子交换低盐上样，没有氯化钠不影响。
是不是柱子有问题？也许介质没处理好。找个阳性对照吧。
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4楼2011-03-07 16:38:05
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
rainwander(金币+2): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-03-07 19:53:43
加热是否对目标蛋白质有影响，怎么上柱前不测定？最好每一步都有蛋白质总量和目标蛋白质总量和活性的数据，不然出了问题也不知道在哪里出，或者出了问题还不能及时发现。

阴离子交换层析需要低盐吸附，高盐洗脱，所以平衡液和蛋白质样品的离子浓度都不能高。你的目标蛋白质等电点在4.3，平衡液的pH值为7.4，产生的电荷差距足够吸附有余了，所以不能吸附的原因是蛋白质早就失去活性，怎么测都测不到，或者平衡液和蛋白质样品离子浓度过高，样品没能被吸附就被洗脱。注意过电导率cond%吗？

无图无真相，如果是用AKTA的，把图截下来发上来。如果是用自动收集仪的，就尽量获得离子强度的测定方法，弄个电导仪。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
5楼2011-03-07 16:41:24
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rhy1027

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
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rainwander(金币+2): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-03-07 19:53:53
首先纠正你一个说法，PBS中的S就是sodium的缩写，也就是说你的buffer是PB（即磷酸缓冲液）不是PBS。
你蛋白的等电点是预测出来的吧，一般来说，预测出来的等电点跟实际值相差不会超过1，但你所描述的情况我也遇到过，换做是我的话，就会直接改变纯化方案了，用阴离子柱反穿后，再做阳离子交换试试，当然这中间一定要彻底脱盐了！但你别指望非特异性吸附柱子会给你多纯的东西，后面的步骤就要“因地制宜”了！根据你目的产物的特性，进一步确立纯化方案！多查查文献吧！
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6楼2011-03-07 16:50:17
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waiter

木虫 (著名写手)

蛋白纯化系统（国产AKTA）销售


★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
楼上的回复非常牛啊。 学习中。
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7楼2011-03-07 16:51:26
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cjl2fl

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
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rainwander(金币+2): 鼓励新虫 2011-03-07 19:54:16
可能是柱子的问题吧，影响蛋白质吸附的因素很多的。离子强度较显著，其次pH，温度。。。。
是不是你配的缓冲有问题？比如缓冲种类，浓度。。。
可以适当控制一下温度，缓冲预先冷一下
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8楼2011-03-07 17:03:49
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i168

金虫 (著名写手)
可能柱子没有活化好吧
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9楼2011-03-07 21:10:17
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tianliudut

银虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
加热蛋白会不会变性？变性后等电点可能会有变化。

阴离子交换不宜用磷酸盐缓冲液。

再有就是要具体问题具体分析，你说的不清楚，不确定因素太多了。
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10楼2011-03-07 21:21:17
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