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酶的纯化问题
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| 在下，目前正在纯化一个酸性酶，用离子交换层析去纯化，结果发现纯化出来的结果，跑电泳出现了6-7条带，并且靠得很近，这样下一步，很难处理，老师想让我用纯化后的蛋白质再去让同一根离子柱，该怎么办？？各位大侠帮忙一下！！！ |
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 电泳、bio-rad 电转化仪及操作 | 【分子生物】EPI帖 |
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2楼2011-11-05 00:40:01
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【答案】应助回帖
mengfei8336(MolEPI+1): 2011-11-09 20:11:17
BIO-che(金币+1): 98分 是个高手 可以看出来 很喜欢你 2011-11-13 00:09:21
BIO-che(金币+1): 98分 是个高手 可以看出来 很喜欢你 2011-11-13 00:09:21
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刚看了楼主的站内短信，特回复如下： 1、关于淀粉酶有多少个亚基的问题，就目前文献报道，我印象中没有看到为多亚基四级结构的alpha-淀粉酶和糖化酶，其它淀粉酶是否为仅有三级结构我就不知道了。 2、楼主用阴离子交换层析，pH5.0的缓冲系统，阴离子交换层析要求使用的pH系统起码比目的蛋白质高1个pH值单位，也就是说此时淀粉酶的等电点小于或者等于4。就未知的淀粉酶来说，在不纯的情况下等电点确定起来存在误差，而小于4的淀粉酶比较少见，我怀疑可能目的蛋白质的等电点高于4.0，pH5.0的体系不一定合适，如果真的如此，则会造成洗脱行为不稳定。加上醋酸-醋酸钠缓冲液不是很稳定的缓冲体系，缓冲区间很窄。如果可以，建议使用6.0，换用其它缓冲体系。 3、关于分子筛，G75的分离范围适用于不超过100KD的蛋白质，要求目的蛋白质与杂质蛋白质分子量为2倍关系，或者相差更大。加上分子筛也不是能将两个蛋白质完全分开的，一个蛋白质的持续出峰时间会较长，造成相互污染。由于你的蛋白质杂带较多，所以我对分离效果不持乐观态度。 4、除了改变体系的pH值之外，还有更好的可能值得尝试，用疏水层析柱。换一种分离原理可能会提高分离效果。假如你们没有纯化仪，那就买空柱和填料自己装一根，不会很贵的。买的时候注意买使用范围广的苯基Phenyl。仅用强阴离子交换层析和凝胶过滤就能使蛋白质纯化，我认为需要很大的运气。 5、纯化之后要跑SDS-PAGE才能判断，下次要上图。 |
7楼2011-11-09 20:04:22
8楼2011-11-09 21:15:48
dasheng1980
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9楼2011-11-11 19:40:01
