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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶的纯化问题
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BIO-che

新虫 (小有名气)

[求助] 酶的纯化问题

在下，目前正在纯化一个酸性酶，用离子交换层析去纯化，结果发现纯化出来的结果，跑电泳出现了6-7条带，并且靠得很近，这样下一步，很难处理，老师想让我用纯化后的蛋白质再去让同一根离子柱，该怎么办？？各位大侠帮忙一下！！！
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1楼 2011-11-05 00:02:30
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江南

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励积极应助！ 2011-11-05 15:08:21
问题说的不大清楚：是用的阴离子交换层析还是阳离子交换层析？缓冲液是什么？pH是多少？ 可以按老师说的做一下，或者改变pH条件试一下，有条件的话可以把这7条带质谱鉴定一下……
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2楼2011-11-05 00:40:01
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BIO-che

新虫 (小有名气)
是用阴离子柱，PH 5.0 用醋酸缓冲液，但是已经用阴离子柱纯化后的蛋白质 去变化缓冲液的PH，再去上同一根柱子会有效果吗？
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3楼2011-11-05 12:10:01
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): Good！高手出手了！ 2011-11-06 00:05:08
不会再有更纯的效果的，除非把你上次的收集管分开，比如1-10都有酶活力，如果把1和10合并再上，那么就有效果，但不一定会比酶活力最高的3（打比方）更加纯。如果把1-10合并再上，无效果。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
4楼2011-11-05 22:56:04
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BIO-che

新虫 (小有名气)
我的电泳图是在有酶的洗脱峰的酶活最大值的4管，进行电泳，结果是6条带，其中有三条靠得很近。这里可能是G75也分不开。那怎么办？这的实验室就是只有离子交换层析和G75了！！！
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5楼2011-11-06 23:55:51
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江南

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你的酶有几个亚基？SDS-PAGE有几条带不一定有几个蛋白，也可能是一个蛋白的几个亚基。
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6楼2011-11-09 10:24:02
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

mengfei8336(MolEPI+1): 2011-11-09 20:11:17
BIO-che(金币+1): 98分 是个高手 可以看出来 很喜欢你 2011-11-13 00:09:21
引用回帖:
4楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-11-05 22:56:04:
不会再有更纯的效果的，除非把你上次的收集管分开，比如1-10都有酶活力，如果把1和10合并再上，那么就有效果，但不一定会比酶活力最高的3（打比方）更加纯。如果把1-10合并再上，无效果。

刚看了楼主的站内短信，特回复如下：

1、关于淀粉酶有多少个亚基的问题，就目前文献报道，我印象中没有看到为多亚基四级结构的alpha-淀粉酶和糖化酶，其它淀粉酶是否为仅有三级结构我就不知道了。

2、楼主用阴离子交换层析，pH5.0的缓冲系统，阴离子交换层析要求使用的pH系统起码比目的蛋白质高1个pH值单位，也就是说此时淀粉酶的等电点小于或者等于4。就未知的淀粉酶来说，在不纯的情况下等电点确定起来存在误差，而小于4的淀粉酶比较少见，我怀疑可能目的蛋白质的等电点高于4.0，pH5.0的体系不一定合适，如果真的如此，则会造成洗脱行为不稳定。加上醋酸-醋酸钠缓冲液不是很稳定的缓冲体系，缓冲区间很窄。如果可以，建议使用6.0，换用其它缓冲体系。

3、关于分子筛，G75的分离范围适用于不超过100KD的蛋白质，要求目的蛋白质与杂质蛋白质分子量为2倍关系，或者相差更大。加上分子筛也不是能将两个蛋白质完全分开的，一个蛋白质的持续出峰时间会较长，造成相互污染。由于你的蛋白质杂带较多，所以我对分离效果不持乐观态度。

4、除了改变体系的pH值之外，还有更好的可能值得尝试，用疏水层析柱。换一种分离原理可能会提高分离效果。假如你们没有纯化仪，那就买空柱和填料自己装一根，不会很贵的。买的时候注意买使用范围广的苯基Phenyl。仅用强阴离子交换层析和凝胶过滤就能使蛋白质纯化，我认为需要很大的运气。

5、纯化之后要跑SDS-PAGE才能判断，下次要上图。
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7楼2011-11-09 20:04:22
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BIO-che

新虫 (小有名气)
非常感谢你们的回复，我以前做过小体积实验，来测不同PH对阴离子柱的吸附作用的影响，在PH 4.0时阴离子柱可以较大地吸附目标酶，但是对酶活会有少量的损伤（对比于5.0 ） 其实PH5-8的4个梯度对阴离子的吸附量的影响是基本相近的。因此，我断定淀粉酶的等电点小于4.0  同时我的淀粉酶是真菌的淀粉酶，我也在想是不是它有可能存在亚基，因此论文上的淀粉酶的分子量大概在60KD左右，而我的竞只有不到40KD，同时有2条带靠得很近，小于30KD。十分吃惊。对于亚基我当时有怀疑过，只是论文上这方面的描述很少，不敢轻下结论！！
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8楼2011-11-09 21:15:48
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dasheng1980

铁杆木虫 (知名作家)

大圣
★
wanhscn(金币+1): 鼓励交流! 2011-11-11 21:40:56
7楼的说的不错，我也建议用一下疏水！
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dasheng1980
9楼2011-11-11 19:40:01
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