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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)

[交流] TEV酶的纯化出问题了，求解？？、

最近要春一批TEV酶用来切HIS标签，PROTOCOL中说的是过NI柱和Q柱纯，过的时候发现蛋白很容易沉（尤其是盐低的时候）；最后Q柱的峰很难看  跑出电泳来发现杂带很多  而且我要的是44KD的蛋白   但在30KD左右却又一条更明显的带。。。。。会不会是只有我要的蛋白沉了？？？
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1楼 2011-08-26 09:26:42
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
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loveskyzhou(金币+1): 2011-08-26 10:44:36
西瓜(金币+3): good 2011-08-26 17:52:55
盐低的时候不只是会沉淀吧，还会自己切自己的；你只能上柱的时候用尽可能高的盐浓度了，或都换其它比较简单的纯化方法，比如多次硫酸铵沉淀，反正只是工具酶，要求也不是非常的高

[ Last edited by ganchao1776 on 2011-8-26 at 12:10 ]
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2楼2011-08-26 10:24:49
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ganchao1776 at 2011-08-26 10:24:49:
盐低，浓度高的时候不只是会沉淀吧，还会自己切自己的；你只能上柱的时候用尽可能高的盐浓度了，或都换其它比较简单的纯化方法，比如多次硫酸铵沉淀，反正只是工具酶，要求也不是非常的高

自己切自己啊。。。我开始也这么想来着 但在过完NI柱后跑的蛋白就有30KD的了，会不会转化有问题  或者质粒退化了
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3楼2011-08-26 10:44:22
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
★
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引用回帖:
3楼: Originally posted by loveskyzhou at 2011-08-26 10:44:22:
自己切自己啊。。。我开始也这么想来着 但在过完NI柱后跑的蛋白就有30KD的了，会不会转化有问题  或者质粒退化了

90%以上不会是质粒的问，只跟表达后的处理有关
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4楼2011-08-26 12:09:53
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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西瓜(金币+5, MolEPI+1): 大牛辛苦了！ 2011-08-27 00:59:34
TEV酶现在可以在实验室自己表达纯化和使用，不一定要买试剂试剂公司的，所以你要自己做这个酶，就先查一下这个质粒是怎么来的，前面有没有人纯化过这个质粒表达的TEV酶，八成是有的，要不然你也拿不到这个质粒，问问他们纯化的操作和结果，再与自己的比较，看看是哪个地方出问题。

大肠杆菌表达蛋白质如果出现包涵体就很麻烦，这时候要先看看上清液中有没有你想要的蛋白质，如果有，那就别做包涵体复性，费时费力还效率特低，宁可摇多一些菌取上清液也别做复性。对于折叠正确的酶来说，在高盐的时候容易变性（6M以上的尿素可以将肽链相互纠缠的包涵体溶解），而在低盐例如20mM Tris-HCl 时能保持良好的溶解状态，例如我的淀粉酶，所以假如你的TEV酶是包涵体用尿素溶解的，那么你就思考一下，看看上清液中存在多少，别碰包涵体了。

假如形成了包涵体，你试一下其它宿主，例如BL21,ROSSETA,Origami（这个是brightfuture01用过，我没用过）等等，很可能有一个宿主表达出来的就主要处于上清液了，我几年前表达过5个纤维素酶基因，都主要在上清液。如果还都是包涵体，那么可能就是表达量多的时候就容易形成包涵体，试一下非表达菌株，例如JM109、EPI100、DH5alpha，可能虽然表达量少，但上清液中有你要的蛋白质。
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5楼2011-08-27 00:22:03
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tsingo

金虫 (正式写手)
★ ★
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西瓜(金币+1): 鼓励下 2011-08-28 16:51:56
应该是TEV蛋白发生了自剪切，纯化之前跑个电泳看看会不会有两条带
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6楼2011-08-27 13:56:42
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tsingo

金虫 (正式写手)
★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-08-28 09:51:53
我们的TEV蛋白只有30左右
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7楼2011-08-27 13:58:37
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florence2011

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
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西瓜(金币+3): 鼓励分享经验 2011-08-28 16:52:17
用大肠杆菌的表达体系就可以在上清表达，tev酶切HIS tag 蛋白不用要求那么高的纯度，直接通过Ni柱纯化就可以用于酶切。我试过，酶切效率挺好的。
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8楼2011-08-28 16:18:18
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rockyss

金虫 (小有名气)
★
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lz用的什么质粒？
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9楼2014-07-24 12:26:21
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lxldlut

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
TEV蛋白酶能不能用在真核表达载体上？
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10楼2015-05-26 10:59:07
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