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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)


[交流] TEV酶的纯化出问题了,求解??、

最近要春一批TEV酶用来切HIS标签,PROTOCOL中说的是过NI柱和Q柱纯,过的时候发现蛋白很容易沉(尤其是盐低的时候);最后Q柱的峰很难看  跑出电泳来发现杂带很多  而且我要的是44KD的蛋白   但在30KD左右却又一条更明显的带。。。。。会不会是只有我要的蛋白沉了???
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小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 大牛辛苦了! 2011-08-27 00:59:34
TEV酶现在可以在实验室自己表达纯化和使用,不一定要买试剂试剂公司的,所以你要自己做这个酶,就先查一下这个质粒是怎么来的,前面有没有人纯化过这个质粒表达的TEV酶,八成是有的,要不然你也拿不到这个质粒,问问他们纯化的操作和结果,再与自己的比较,看看是哪个地方出问题。

大肠杆菌表达蛋白质如果出现包涵体就很麻烦,这时候要先看看上清液中有没有你想要的蛋白质,如果有,那就别做包涵体复性,费时费力还效率特低,宁可摇多一些菌取上清液也别做复性。对于折叠正确的酶来说,在高盐的时候容易变性(6M以上的尿素可以将肽链相互纠缠的包涵体溶解),而在低盐例如20mM Tris-HCl 时能保持良好的溶解状态,例如我的淀粉酶,所以假如你的TEV酶是包涵体用尿素溶解的,那么你就思考一下,看看上清液中存在多少,别碰包涵体了。

假如形成了包涵体,你试一下其它宿主,例如BL21,ROSSETA,Origami(这个是brightfuture01用过,我没用过)等等,很可能有一个宿主表达出来的就主要处于上清液了,我几年前表达过5个纤维素酶基因,都主要在上清液。如果还都是包涵体,那么可能就是表达量多的时候就容易形成包涵体,试一下非表达菌株,例如JM109、EPI100、DH5alpha,可能虽然表达量少,但上清液中有你要的蛋白质。
5楼2011-08-27 00:22:03
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