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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » TEV酶的纯化出问题了，求解？？、
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 大牛辛苦了！ 2011-08-27 00:59:34
TEV酶现在可以在实验室自己表达纯化和使用，不一定要买试剂试剂公司的，所以你要自己做这个酶，就先查一下这个质粒是怎么来的，前面有没有人纯化过这个质粒表达的TEV酶，八成是有的，要不然你也拿不到这个质粒，问问他们纯化的操作和结果，再与自己的比较，看看是哪个地方出问题。

大肠杆菌表达蛋白质如果出现包涵体就很麻烦，这时候要先看看上清液中有没有你想要的蛋白质，如果有，那就别做包涵体复性，费时费力还效率特低，宁可摇多一些菌取上清液也别做复性。对于折叠正确的酶来说，在高盐的时候容易变性（6M以上的尿素可以将肽链相互纠缠的包涵体溶解），而在低盐例如20mM Tris-HCl 时能保持良好的溶解状态，例如我的淀粉酶，所以假如你的TEV酶是包涵体用尿素溶解的，那么你就思考一下，看看上清液中存在多少，别碰包涵体了。

假如形成了包涵体，你试一下其它宿主，例如BL21,ROSSETA,Origami（这个是brightfuture01用过，我没用过）等等，很可能有一个宿主表达出来的就主要处于上清液了，我几年前表达过5个纤维素酶基因，都主要在上清液。如果还都是包涵体，那么可能就是表达量多的时候就容易形成包涵体，试一下非表达菌株，例如JM109、EPI100、DH5alpha，可能虽然表达量少，但上清液中有你要的蛋白质。
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5楼2011-08-27 00:22:03
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