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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白酶分离纯化
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majunyang

银虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白酶分离纯化

蛋白酶同工酶的分离纯化，文献中阴离子交换用pH7.4的缓冲液出现在洗脱峰，而我用pH7.4的缓冲液活性峰总是出现在穿透峰，是怎么回事啊？？？？？谢谢，不胜感激。
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.。。。。。。。。。。。
1楼 2012-02-16 08:41:02
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回帖置顶 ( 共有1个 )

chlorella409

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
silicare(金币+8, BioEPI+1): 鼓励新虫发帖交流 2012-02-16 12:59:15
阴离子交换柱纯化蛋白是看缓冲液中的盐离子浓度的，PH7.4只是作为缓冲保证蛋白活性的，你用阴离子交换柱要用盐梯度来洗脱，一般都是氯化钠，从0摩尔开始，逐渐增加盐的浓度，上限不定
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2楼2012-02-16 09:00:51
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普通回帖

majunyang

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by chlorella409 at 2012-02-16 09:00:51:
阴离子交换柱纯化蛋白是看缓冲液中的盐离子浓度的，PH7.4只是作为缓冲保证蛋白活性的，你用阴离子交换柱要用盐梯度来洗脱，一般都是氯化钠，从0摩尔开始，逐渐增加盐的浓度，上限不定

恩啊，我先用3个柱体积的缓冲液淋洗不吸附在柱上的蛋白，再用含1mol/L的缓冲液洗脱，活性峰总是出现在穿透峰里。
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.。。。。。。。。。。。
3楼2012-02-16 09:05:13
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chlorella409

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
上样过程是这样的，首先是样品上柱，这时候目的蛋白和一部分杂蛋白都会傍柱的，这时候出来的是FlowThrough里面应该有不上柱的杂蛋白，接下来在用无盐buffer冲洗一定的柱体积，会冲洗出一定量结合不牢固的蛋白，然后再用含盐的buffer洗脱，这一步要逐渐增加盐的浓度，可以拉线性也可以走梯度，一般不会直接用1摩尔的盐洗脱，应为1摩尔的盐基本上能洗脱阴离子柱上所有的蛋白了。
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4楼2012-02-17 08:49:12
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yaokuaile

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by chlorella409 at 2012-02-17 08:49:12
上样过程是这样的，首先是样品上柱，这时候目的蛋白和一部分杂蛋白都会傍柱的，这时候出来的是FlowThrough里面应该有不上柱的杂蛋白，接下来在用无盐buffer冲洗一定的柱体积，会冲洗出一定量结合不牢固的蛋白，然后 ...

你好，我用阴离子柱纯化，目的蛋白也是在流穿中出来，但是同时有很多杂蛋白，我现在用的是初盐为0的buffer，后面用NaCl梯度洗脱，但是再过了S200之后还有有很多杂蛋白。不知道你有没有什么好的方法可以指点一下？
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5楼2013-06-10 17:02:13
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jwt345532945

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

缓冲液浓度太大，你用1M的缓冲液，能洗脱所有的蛋白了，一般10-50mM的可以了啊
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6楼2013-06-11 10:57:13
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chlorella409

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by yaokuaile at 2013-06-10 17:02:13
你好，我用阴离子柱纯化，目的蛋白也是在流穿中出来，但是同时有很多杂蛋白，我现在用的是初盐为0的buffer，后面用NaCl梯度洗脱，但是再过了S200之后还有有很多杂蛋白。不知道你有没有什么好的方法可以指点一下？...

如果你用阴离子柱，目的蛋白在穿流中出来的话，有的杂蛋白也是会不挂柱的，而且上离子交换柱时，是要有一定的初始盐浓度，大概50-100mM，如果蛋白在穿流里，柱子上目的蛋白就很少了，再洗脱也没有太大必要，你可是换阳离子交换柱，目的蛋白挂柱，再用盐洗脱。还有是杂蛋白如果和目的蛋白大小靠近的话，分子筛是分不了的。
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7楼2013-06-13 12:14:07
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