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majunyang

银虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白酶分离纯化

蛋白酶同工酶的分离纯化,文献中阴离子交换用pH7.4的缓冲液出现在洗脱峰,而我用pH7.4的缓冲液活性峰总是出现在穿透峰,是怎么回事啊?????谢谢,不胜感激。
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chlorella409

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
silicare(金币+8, BioEPI+1): 鼓励新虫发帖交流 2012-02-16 12:59:15
阴离子交换柱纯化蛋白是看缓冲液中的盐离子浓度的,PH7.4只是作为缓冲保证蛋白活性的,你用阴离子交换柱要用盐梯度来洗脱,一般都是氯化钠,从0摩尔开始,逐渐增加盐的浓度,上限不定
2楼2012-02-16 09:00:51
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普通回帖

majunyang

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
: Originally posted by chlorella409 at 2012-02-16 09:00:51:
阴离子交换柱纯化蛋白是看缓冲液中的盐离子浓度的,PH7.4只是作为缓冲保证蛋白活性的,你用阴离子交换柱要用盐梯度来洗脱,一般都是氯化钠,从0摩尔开始,逐渐增加盐的浓度,上限不定

恩啊,我先用3个柱体积的缓冲液淋洗不吸附在柱上的蛋白,再用含1mol/L的缓冲液洗脱,活性峰总是出现在穿透峰里。
.。。。。。。。。。。。
3楼2012-02-16 09:05:13
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chlorella409

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
上样过程是这样的,首先是样品上柱,这时候目的蛋白和一部分杂蛋白都会傍柱的,这时候出来的是FlowThrough里面应该有不上柱的杂蛋白,接下来在用无盐buffer冲洗一定的柱体积,会冲洗出一定量结合不牢固的蛋白,然后再用含盐的buffer洗脱,这一步要逐渐增加盐的浓度,可以拉线性也可以走梯度,一般不会直接用1摩尔的盐洗脱,应为1摩尔的盐基本上能洗脱阴离子柱上所有的蛋白了。
4楼2012-02-17 08:49:12
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yaokuaile

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by chlorella409 at 2012-02-17 08:49:12
上样过程是这样的,首先是样品上柱,这时候目的蛋白和一部分杂蛋白都会傍柱的,这时候出来的是FlowThrough里面应该有不上柱的杂蛋白,接下来在用无盐buffer冲洗一定的柱体积,会冲洗出一定量结合不牢固的蛋白,然后 ...

你好,我用阴离子柱纯化,目的蛋白也是在流穿中出来,但是同时有很多杂蛋白,我现在用的是初盐为0的buffer,后面用NaCl梯度洗脱,但是再过了S200之后还有有很多杂蛋白。不知道你有没有什么好的方法可以指点一下?
5楼2013-06-10 17:02:13
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jwt345532945

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

缓冲液浓度太大,你用1M的缓冲液,能洗脱所有的蛋白了,一般10-50mM的可以了啊
6楼2013-06-11 10:57:13
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chlorella409

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by yaokuaile at 2013-06-10 17:02:13
你好,我用阴离子柱纯化,目的蛋白也是在流穿中出来,但是同时有很多杂蛋白,我现在用的是初盐为0的buffer,后面用NaCl梯度洗脱,但是再过了S200之后还有有很多杂蛋白。不知道你有没有什么好的方法可以指点一下?...

如果你用阴离子柱,目的蛋白在穿流中出来的话,有的杂蛋白也是会不挂柱的,而且上离子交换柱时,是要有一定的初始盐浓度,大概50-100mM,如果蛋白在穿流里,柱子上目的蛋白就很少了,再洗脱也没有太大必要,你可是换阳离子交换柱,目的蛋白挂柱,再用盐洗脱。还有是杂蛋白如果和目的蛋白大小靠近的话,分子筛是分不了的。
7楼2013-06-13 12:14:07
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