应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » TEV酶的纯化出问题了，求解？？、
51/1返回列表
查看: 4815  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

loveskyzhou

铁虫 (正式写手)

[交流] TEV酶的纯化出问题了，求解？？、

最近要春一批TEV酶用来切HIS标签，PROTOCOL中说的是过NI柱和Q柱纯，过的时候发现蛋白很容易沉（尤其是盐低的时候）；最后Q柱的峰很难看  跑出电泳来发现杂带很多  而且我要的是44KD的蛋白   但在30KD左右却又一条更明显的带。。。。。会不会是只有我要的蛋白沉了？？？
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

核酸生物学实验经验 【分子生物】EPI帖

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2011-08-26 09:26:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

loveskyzhou

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ganchao1776 at 2011-08-26 10:24:49:
盐低，浓度高的时候不只是会沉淀吧，还会自己切自己的；你只能上柱的时候用尽可能高的盐浓度了，或都换其它比较简单的纯化方法，比如多次硫酸铵沉淀，反正只是工具酶，要求也不是非常的高

自己切自己啊。。。我开始也这么想来着 但在过完NI柱后跑的蛋白就有30KD的了，会不会转化有问题  或者质粒退化了
赞一下 回复此楼
3楼2011-08-26 10:44:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答

ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
loveskyzhou(金币+1): 2011-08-26 10:44:36
西瓜(金币+3): good 2011-08-26 17:52:55
盐低的时候不只是会沉淀吧，还会自己切自己的；你只能上柱的时候用尽可能高的盐浓度了，或都换其它比较简单的纯化方法，比如多次硫酸铵沉淀，反正只是工具酶，要求也不是非常的高

[ Last edited by ganchao1776 on 2011-8-26 at 12:10 ]
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2011-08-26 10:24:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by loveskyzhou at 2011-08-26 10:44:22:
自己切自己啊。。。我开始也这么想来着 但在过完NI柱后跑的蛋白就有30KD的了，会不会转化有问题  或者质粒退化了

90%以上不会是质粒的问，只跟表达后的处理有关
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2011-08-26 12:09:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 大牛辛苦了！ 2011-08-27 00:59:34
TEV酶现在可以在实验室自己表达纯化和使用，不一定要买试剂试剂公司的，所以你要自己做这个酶，就先查一下这个质粒是怎么来的，前面有没有人纯化过这个质粒表达的TEV酶，八成是有的，要不然你也拿不到这个质粒，问问他们纯化的操作和结果，再与自己的比较，看看是哪个地方出问题。

大肠杆菌表达蛋白质如果出现包涵体就很麻烦，这时候要先看看上清液中有没有你想要的蛋白质，如果有，那就别做包涵体复性，费时费力还效率特低，宁可摇多一些菌取上清液也别做复性。对于折叠正确的酶来说，在高盐的时候容易变性（6M以上的尿素可以将肽链相互纠缠的包涵体溶解），而在低盐例如20mM Tris-HCl 时能保持良好的溶解状态，例如我的淀粉酶，所以假如你的TEV酶是包涵体用尿素溶解的，那么你就思考一下，看看上清液中存在多少，别碰包涵体了。

假如形成了包涵体，你试一下其它宿主，例如BL21,ROSSETA,Origami（这个是brightfuture01用过，我没用过）等等，很可能有一个宿主表达出来的就主要处于上清液了，我几年前表达过5个纤维素酶基因，都主要在上清液。如果还都是包涵体，那么可能就是表达量多的时候就容易形成包涵体，试一下非表达菌株，例如JM109、EPI100、DH5alpha，可能虽然表达量少，但上清液中有你要的蛋白质。
赞一下(2人) 回复此楼
5楼2011-08-27 00:22:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +37 医学老男孩 2026-08-13 87/4350 2026-08-18 06:35 by 医学老男孩
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +6 angus9576 2026-08-17 11/550 2026-08-17 23:57 by angus9576
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +8 wangze12014 2026-08-14 10/500 2026-08-17 17:05 by xter9665
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +4 基诺咪客 2026-08-17 4/200 2026-08-17 16:10 by Vivilian
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +8 zju2000 2026-08-16 9/450 2026-08-17 12:20 by lmz0216
[基金申请] 2027广东省杰青 +3 奶牛小黑 2026-08-15 6/300 2026-08-16 20:07 by 奶牛小黑
[基金申请] 快农历七夕节了，轻松一下，男人悄悄话，女施主请不要进来。 +3 Tide man 2026-08-14 3/150 2026-08-16 17:47 by jurkat.1640
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +7 启萌科技 2026-08-12 26/1300 2026-08-16 12:35 by 启萌科技
[基金申请] 有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验） +10 majunge000 2026-08-11 12/600 2026-08-16 08:18 by xli1984
[精细化工] 招聘 金属平磨液，抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果？ +4 yuleib84 2026-08-11 4/200 2026-08-14 23:05 by lfy8008
[硕博家园] 读博的好处 +4 lnee 2026-08-11 4/200 2026-08-14 10:20 by ahsoarli
[基金申请] 重要来源：本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] 不应该看fileCode +7 且听虎啸 2026-08-12 9/450 2026-08-13 14:27 by flydreamws
[基金申请] Filecode 又变了，巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +4 布布和一二 2026-08-11 5/250 2026-08-13 12:56 by cratir
[基金申请] 结合人工智能，周易传统文化，filecode打分制来了，3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见，大家看看几个A，几个B? +11 Tide man 2026-08-11 11/550 2026-08-13 07:35 by 撸猫猫
[基金申请] 什么时候出结果，有咨询渠道？？？ +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭