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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

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【答案】应助回帖

mengfei8336(MolEPI+1): 2011-11-09 20:11:17
BIO-che(金币+1): 98分是个高手可以看出来很喜欢你 2011-11-13 00:09:21

引用回帖:

4楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-11-05 22:56:04:
不会再有更纯的效果的，除非把你上次的收集管分开，比如1-10都有酶活力，如果把1和10合并再上，那么就有效果，但不一定会比酶活力最高的3（打比方）更加纯。如果把1-10合并再上，无效果。

刚看了楼主的站内短信，特回复如下：

1、关于淀粉酶有多少个亚基的问题，就目前文献报道，我印象中没有看到为多亚基四级结构的alpha-淀粉酶和糖化酶，其它淀粉酶是否为仅有三级结构我就不知道了。

2、楼主用阴离子交换层析，pH5.0的缓冲系统，阴离子交换层析要求使用的pH系统起码比目的蛋白质高1个pH值单位，也就是说此时淀粉酶的等电点小于或者等于4。就未知的淀粉酶来说，在不纯的情况下等电点确定起来存在误差，而小于4的淀粉酶比较少见，我怀疑可能目的蛋白质的等电点高于4.0，pH5.0的体系不一定合适，如果真的如此，则会造成洗脱行为不稳定。加上醋酸-醋酸钠缓冲液不是很稳定的缓冲体系，缓冲区间很窄。如果可以，建议使用6.0，换用其它缓冲体系。

3、关于分子筛，G75的分离范围适用于不超过100KD的蛋白质，要求目的蛋白质与杂质蛋白质分子量为2倍关系，或者相差更大。加上分子筛也不是能将两个蛋白质完全分开的，一个蛋白质的持续出峰时间会较长，造成相互污染。由于你的蛋白质杂带较多，所以我对分离效果不持乐观态度。

4、除了改变体系的pH值之外，还有更好的可能值得尝试，用疏水层析柱。换一种分离原理可能会提高分离效果。假如你们没有纯化仪，那就买空柱和填料自己装一根，不会很贵的。买的时候注意买使用范围广的苯基Phenyl。仅用强阴离子交换层析和凝胶过滤就能使蛋白质纯化，我认为需要很大的运气。

5、纯化之后要跑SDS-PAGE才能判断，下次要上图。