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DXY1

新虫 (初入文坛)

[求助] CM-52纯化蛋白问题

用CM-52对蛋白质进行纯化,以前能纯化出目的蛋白,昨天纯化鸡溶菌酶也能纯化出,但今天纯化目的蛋白,流出液完全检测不出UV值,疑似没有蛋白流出,不知道是怎么回事
洗脱液和柱子都换成新的,不过柱子是自己装的
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
弱阴离子交换,是不是含盐量太高导致不能吸附蛋白质。
流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2012-08-05 01:43:56
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mzhyan

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

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重新再装个柱子再试试看。
3楼2012-08-05 08:00:51
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会思想的芦苇

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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明明是弱阳离子介质嘛,一楼说的有误,楼主信息太少没法指导,buffer 蛋白pI都没有
4楼2012-08-05 09:22:53
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

引用回帖:
4楼: Originally posted by 会思想的芦苇 at 2012-08-05 09:22:53
明明是弱阳离子介质嘛,一楼说的有误,楼主信息太少没法指导,buffer 蛋白pI都没有

我看错了
流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
5楼2012-08-05 18:20:57
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DXY1

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2012-08-05 01:43:56
弱阴离子交换,是不是含盐量太高导致不能吸附蛋白质。

是弱阴离子交换柱,如果不能吸附蛋白质的话,那蛋白质应该会流出来,那紫外应该会被检测到,现在是流出的液体中检测不到UV值得变化
6楼2012-08-06 18:34:15
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DXY1

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 会思想的芦苇 at 2012-08-05 09:22:53
明明是弱阳离子介质嘛,一楼说的有误,楼主信息太少没法指导,buffer 蛋白pI都没有

用于洗脱的是,醋酸铵 一个是PH为5.8 浓度为10mM,另一个为PH=8.0,浓度为300mM,蛋白质的PH为5
7楼2012-08-06 18:38:58
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会思想的芦苇

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by DXY1 at 2012-08-06 18:38:58
用于洗脱的是,醋酸铵 一个是PH为5.8 浓度为10mM,另一个为PH=8.0,浓度为300mM,蛋白质的PH为5...

我没理解错的话,你的平衡缓冲液是pH8.0,蛋白等电点是5,那么在平衡buffer条件下,蛋白带负点,而CM是阳离子介质,蛋白是不会和介质结合的,所以洗脱没信号也很正常,而你所说的能结合溶菌酶没错,因为溶菌酶是碱性蛋白,pI好像是9.0多吧,在pH8.0时是带正电,所以洗脱时也有信号,另外,很少做离子交换层析时用改变pH洗脱,一般都增加盐浓度,但改变pH也没错,一般来讲,阳离子交换,增加pH洗脱,阴离子交换,降低pH洗脱。
8楼2012-08-07 19:46:32
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会思想的芦苇

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by 会思想的芦苇 at 2012-08-07 19:46:32
我没理解错的话,你的平衡缓冲液是pH8.0,蛋白等电点是5,那么在平衡buffer条件下,蛋白带负点,而CM是阳离子介质,蛋白是不会和介质结合的,所以洗脱没信号也很正常,而你所说的能结合溶菌酶没错,因为溶菌酶是碱性 ...

等电点为5的酸性蛋白,如果要用吸附模式纯化,建议选择DEAE或Q等阴离子介质
9楼2012-08-07 19:50:15
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DXY1

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 会思想的芦苇 at 2012-08-07 19:46:32
我没理解错的话,你的平衡缓冲液是pH8.0,蛋白等电点是5,那么在平衡buffer条件下,蛋白带负点,而CM是阳离子介质,蛋白是不会和介质结合的,所以洗脱没信号也很正常,而你所说的能结合溶菌酶没错,因为溶菌酶是碱性 ...

我的平衡缓冲液是PH=5.8的醋酸铵,还有就是是用的弱阳离子交换柱
10楼2012-08-08 10:06:49
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