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C-JingX

金虫 (小有名气)

[求助] 蛋白纯化问题

求助：包涵体纯化，方法是镍柱亲和层析，问题是每次蛋白都在洗杂蛋白时被洗下来，尝试了很多方法，不知道怎么优化？还有个疑问是，组氨酸只有6个，但目的蛋白有100多KDa，会不会是因为蛋白太大，6个组氨酸与镍柱的亲和力无法承受这么大蛋白，就像常用的粘钩一样，挂太重的东西就会直接掉下来呢？？？
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走自己的路，不要追逐别人的脚步！
1楼 2011-09-25 11:19:11
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aayqaa

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

C-JingX(金币+1): 如果是不能结合的话，那上样的时候就应该直接流出来了啊，怎么还会在杂蛋白里面呢？？ 2011-09-26 10:01:45
组氨酸部分可能碰巧被包裹在了蛋白的内部导致无法结合
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2楼2011-09-25 19:32:18
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丙氨酸密码子

新虫 (小有名气)
★
wanhscn(金币+1): 鼓励交流 2011-09-26 22:59:53
我现在还没做到这一步呢，哎，，我还在艰难的徘徊在PCR上面，提RNA，RT-PCR啊，，， 郁闷啊。
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3楼2011-09-25 19:48:32
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励交流! 2011-09-26 23:00:14
已经也碰到过几个蛋白是这种情况，无解。
你可以试试变性后纯化或复性后纯化，看有没有区别。
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生物资源交流QQ群：1044518333
4楼2011-09-25 19:54:40
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临风7071

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-09-27 07:38:19
C-JingX(金币+2): 换在真核中表达啊，那样会不会更难啊，我们实验室真核的就只有酵母 2011-09-28 09:45:45
那建议楼主换标签吧，GST的，实在不行，就在真核生物中表达吧
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5楼2011-09-26 21:46:12
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256k

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励交流 2011-11-07 21:42:20
C-JingX(金币+2): 谢谢啊！ 2011-11-09 09:49:28
不挂柱可能是蛋白在折叠过程中his标签被折叠到蛋白内部，基本无解
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6楼2011-11-07 20:37:25
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fanya007711

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
wanhscn(金币+4): 鼓励应助！鼓励新虫友回帖！ 2011-11-07 21:42:53
C-JingX(金币+1): 谢谢！ 2011-11-09 09:51:31
我的蛋白有160K，同样也挂得牢牢的啊！
除上面说的，LZ检查一下缓冲液的成分，比方说一定不能有EDTA等
如LZ使用了超声波破碎的话，建议不要超声太长的时间，否则蛋白碳化也会流穿。
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7楼2011-11-07 21:17:37
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jiangyhai

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
wanhscn(金币+1): 鼓励应助！ 2011-11-08 11:31:38
C-JingX(金币+1): 谢谢！ 2011-11-09 09:51:19
考虑将6xHis换到蛋白的另一端试试。
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静心做事。
8楼2011-11-08 10:42:07
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sl35537417

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 好主意 2011-11-08 22:05:35
C-JingX(金币+3): 呵呵，谢谢啊，我试试！ 2011-11-09 09:50:57
引用回帖:
1楼: Originally posted by C-JingX at 2011-09-25 11:19:11:
求助：包涵体纯化，方法是镍柱亲和层析，问题是每次蛋白都在洗杂蛋白时被洗下来，尝试了很多方法，不知道怎么优化？还有个疑问是，组氨酸只有6个，但目的蛋白有100多KDa，会不会是因为蛋白太大，6个组氨酸与镍柱的 ...

建议更换表达载体或者将his标签更换到目的基因的另一端（即所谓的N端或C端），还可以两端同时加上his标签
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9楼2011-11-08 15:25:45
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丙氨酸密码子

新虫 (小有名气)
呵，，看到我之前的回帖了，， 我也打算明天做蛋白纯化了，， 希望顺利吧，，， 也祝福lz
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10楼2011-11-08 21:28:47
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