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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请高手解答细胞瞬转蛋白提取及纯化
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yuanalice

银虫 (小有名气)

[求助] 请高手解答细胞瞬转蛋白提取及纯化

目前想得到一个改造过的蛋白，想通过瞬转COS-7后得到蛋白，免疫荧光检测目的蛋白已经得到较高表达（大于50%），想进一步纯化出我想要的蛋白，目前纯在的问题有以下几点：
1.细胞的裂解，因为要保证蛋白的活性，是不是还是采用温和的裂解方法，有没有比较好用的裂解液推荐一下。
2。因为我的蛋白等电点在9左右，想用阳离子交换层析的方法，拟采用SP SepharoseF   F,用50mMOL的磷酸盐缓冲液，以0-1Mol 氯化钠洗脱。
3.用分子筛进一步纯化蛋白。
不知道这样的方法是否可行，本来想委托公司纯化，可是公司说必须从转染开始就委托给他们，否则不好说能得到多少纯化样品，而且答复是真核蛋白裂解细胞纯化得到的蛋白纯度很低，到不了50%，可是这种纯度没办法继续用于下游的活性鉴定！请高手帮忙看看！多谢啦
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1楼 2013-03-09 09:49:39
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回帖置顶 ( 共有1个 )

panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yuanalice: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-03-09 17:02:18
amisking: 回帖置顶 2013-03-09 18:29:25
你是设计的胞内表达吗？如果可能，我建议你设计成为分泌表达，目的蛋白表达到培养上清中，最好加上一些方便纯化的tag(如His tag， Fc tag等），希望对你有帮助
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3楼2013-03-09 15:46:07
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peakg7

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流！ 2013-03-09 18:29:21
yuanalice: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-03-11 15:05:12
我感觉你的蛋白这样很难纯化出出来。你可以使用proteinG 来纯化，出来的纯度肯定超高50%
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2楼2013-03-09 10:56:01
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yuanalice

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by panda73 at 2013-03-09 15:46:07
你是设计的胞内表达吗？如果可能，我建议你设计成为分泌表达，目的蛋白表达到培养上清中，最好加上一些方便纯化的tag(如His tag， Fc tag等），希望对你有帮助

是分泌表达，但是上清的浓度较低，免疫荧光检测细胞内蛋白较明显，因为是瞬转，因此考虑破碎细胞纯化蛋白呢
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4楼2013-03-09 17:03:37
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