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晴天1882木虫 (正式写手)
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提取细胞蛋白
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是提取细胞中的HMGR和LDLR蛋白，然后做Western blot HMGR：细胞内质网蛋白结合酶，LDLR：细胞膜蛋白 1：HepG2细胞培养在1640培养基中 2：一瓶细胞点六孔板，让细胞在六孔板中长24小时，细胞在孔中有时能长到80-90%，有时候长不到，但有个50-60的样子，也接着往下做 3：给不同浓度的药，换无血清培养基培养24小时 4：弃去培养基，用预冷的PBS洗三遍，直接加450ul强裂解液（含PMSF），于冰上摇晃好几个小时 5：最后，没有离心，因为感觉不浑浊，没有太多沉淀，直接移到离心管中做实验 最后做不出目的蛋白，内参能做出来，但也不是每个孔都能做出来，现在是觉得我的提取过程有问题，请大家帮忙看看我的提取步骤到底有没有问题啊？ |
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2楼2012-05-14 18:58:01
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试下像细菌一样 ，直接加SDS loading buffer 沸水浴下 跑胶 western ， western最好确定抗体好用，还有多弄点细胞，增加目的蛋白量以加强信号 还有个原因可能是背景太大，也就是杂蛋白太多 ，导致信号弱，检测不出来，裂解后可以12000或者更高转速离心下，减少杂蛋白以减少背景，做之前确定你的蛋白是在上清中，可以做的时候离心下来的沉淀也一起跑胶做，这样即使在沉淀中叶可以检测出来 |
3楼2012-05-14 20:18:11
晴天1882
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1：HepG2细胞培养在1640培养基中 没有问题 2：一瓶细胞点六孔板，让细胞在六孔板中长24小时，细胞在孔中有时能长到80-90%，有时候长不到，但有个50-60的样子，也接着往下做 HepG2，肝癌细胞，生长速度很快，六孔板24h才50%融合度，怀疑传代时细胞密度过小，或细胞状态不好。 3：给不同浓度的药，换无血清培养基培养24小时 一般处理后，我都会显微镜下观察，看是否漂浮的细胞比较多。有些药物处理会杀死细胞或使细胞脱吸附。 4：弃去培养基，用预冷的PBS洗三遍，直接加450ul强裂解液（含PMSF），于冰上摇晃好几个小时 这一步问题比较大，我也做过HepG2细胞，我们一般6孔板，超过80%融合度都只加不超过150ul的裂解液。加裂解液后，直接用细胞刮子收集细胞，然后冰上裂解半小时，离心。时间过长，蛋白容易降解，虽然加了PMSF。建议还可以考虑添加蛋白酶抑制剂。 5：最后，没有离心，因为感觉不浑浊，没有太多沉淀，直接移到离心管中做实验 内参是细胞中表达较强的蛋白，内参做出来目的蛋白不一定能做出来。总结楼主的问题可能出在1.裂解液过多导致蛋白浓度低。2.裂解时间过长，蛋白降解。3.未提到用细胞刮子收集，可能收集不完全。 最后，还是建议要离心，4度，12000rmp，5min |
8楼2012-05-15 09:27:06
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