| 查看: 4702 | 回复: 14 | ||
晴天1882木虫 (正式写手)
|
[求助]
提取细胞蛋白
|
|
是提取细胞中的HMGR和LDLR蛋白，然后做Western blot HMGR：细胞内质网蛋白结合酶，LDLR：细胞膜蛋白 1：HepG2细胞培养在1640培养基中 2：一瓶细胞点六孔板，让细胞在六孔板中长24小时，细胞在孔中有时能长到80-90%，有时候长不到，但有个50-60的样子，也接着往下做 3：给不同浓度的药，换无血清培养基培养24小时 4：弃去培养基，用预冷的PBS洗三遍，直接加450ul强裂解液（含PMSF），于冰上摇晃好几个小时 5：最后，没有离心，因为感觉不浑浊，没有太多沉淀，直接移到离心管中做实验 最后做不出目的蛋白，内参能做出来，但也不是每个孔都能做出来，现在是觉得我的提取过程有问题，请大家帮忙看看我的提取步骤到底有没有问题啊？ |
回复此楼» 猜你喜欢
材料与化工一志愿南昌大学327求调剂推荐
已经有8人回复
-
0703 物理化学调剂
已经有5人回复
-
化学工程321分求调剂
已经有7人回复
-
0703化学调剂 290分有科研经历，论文在投
已经有7人回复
-
308求调剂
已经有3人回复
-
本人考085602 化学工程 专硕
已经有10人回复
-
焦虑
已经有9人回复
-
0856求调剂
已经有3人回复
-
283求调剂
已经有11人回复
-
深圳大学硕士招生（2026秋，传感器方向，仅录取第一志愿）
已经有8人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 胡萝卜质外体蛋白
已经有3人回复
- WB电泳时，蛋白样品堵在上样口
已经有14人回复
- 如何提取有活性的蛋白质？
已经有3人回复
- 【求助】+ 提取的蛋白含量太低
已经有5人回复
- 动物细胞蛋白提取含量低
已经有11人回复
- 【求助】蛋白提取
已经有6人回复
- 【求助/交流】线粒体的提取及活性检测
已经有8人回复
- 【求助/交流】请问用RIPA裂解液裂解后的蛋白能做ELISA吗？
已经有6人回复
- 【求助/交流】细胞核内蛋白和细胞浆蛋白提取有什么区别？
已经有4人回复
- 【求助/交流】【交流】致病菌与宿主细胞相互作用关系的研究
已经有9人回复
- 【求助】从细胞中提取的线粒体还能保持原有的生理活性吗？
已经有10人回复
- 【分享】高人整理的细胞总蛋白的提取
已经有17人回复
- 【求助/交流】用96孔板怎样提取蛋白质
已经有4人回复
2楼2012-05-14 18:58:01
wen1023tao
铜虫 (小有名气)
- BioEPI: 1
- 应助: 27 (小学生)
- 金币: 176.1
- 红花: 1
- 帖子: 82
- 在线: 20.9小时
- 虫号: 1387766
- 注册: 2011-09-02
- 性别: GG
- 专业: 植物遗传学
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-05-14 21:20:13
晴天1882: 金币+1 2012-05-16 10:06:33
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-05-14 21:20:13
晴天1882: 金币+1 2012-05-16 10:06:33
|
试下像细菌一样 ，直接加SDS loading buffer 沸水浴下 跑胶 western ， western最好确定抗体好用，还有多弄点细胞，增加目的蛋白量以加强信号 还有个原因可能是背景太大，也就是杂蛋白太多 ，导致信号弱，检测不出来，裂解后可以12000或者更高转速离心下，减少杂蛋白以减少背景，做之前确定你的蛋白是在上清中，可以做的时候离心下来的沉淀也一起跑胶做，这样即使在沉淀中叶可以检测出来 |
3楼2012-05-14 20:18:11
晴天1882
木虫 (正式写手)
- 应助: 19 (小学生)
- 金币: 4077.5
- 散金: 18
- 红花: 5
- 沙发: 1
- 帖子: 647
- 在线: 424.3小时
- 虫号: 744363
- 注册: 2009-04-09
- 性别: MM
- 专业: 生物化学
4楼2012-05-14 21:41:52
晴天1882
木虫 (正式写手)
- 应助: 19 (小学生)
- 金币: 4077.5
- 散金: 18
- 红花: 5
- 沙发: 1
- 帖子: 647
- 在线: 424.3小时
- 虫号: 744363
- 注册: 2009-04-09
- 性别: MM
- 专业: 生物化学
5楼2012-05-14 21:45:41
6楼2012-05-14 22:06:56
晴天1882
木虫 (正式写手)
- 应助: 19 (小学生)
- 金币: 4077.5
- 散金: 18
- 红花: 5
- 沙发: 1
- 帖子: 647
- 在线: 424.3小时
- 虫号: 744363
- 注册: 2009-04-09
- 性别: MM
- 专业: 生物化学
7楼2012-05-15 08:42:57
shenyang24
木虫 (正式写手)
- 应助: 9 (幼儿园)
- 金币: 4000
- 红花: 1
- 帖子: 365
- 在线: 411.2小时
- 虫号: 255903
- 注册: 2006-05-28
- 性别: GG
- 专业: 生物材料
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
晴天1882: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-05-16 10:05:45
晴天1882: 金币+1 2012-05-16 10:07:57
感谢参与，应助指数 +1
晴天1882: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-05-16 10:05:45
晴天1882: 金币+1 2012-05-16 10:07:57
|
1：HepG2细胞培养在1640培养基中 没有问题 2：一瓶细胞点六孔板，让细胞在六孔板中长24小时，细胞在孔中有时能长到80-90%，有时候长不到，但有个50-60的样子，也接着往下做 HepG2，肝癌细胞，生长速度很快，六孔板24h才50%融合度，怀疑传代时细胞密度过小，或细胞状态不好。 3：给不同浓度的药，换无血清培养基培养24小时 一般处理后，我都会显微镜下观察，看是否漂浮的细胞比较多。有些药物处理会杀死细胞或使细胞脱吸附。 4：弃去培养基，用预冷的PBS洗三遍，直接加450ul强裂解液（含PMSF），于冰上摇晃好几个小时 这一步问题比较大，我也做过HepG2细胞，我们一般6孔板，超过80%融合度都只加不超过150ul的裂解液。加裂解液后，直接用细胞刮子收集细胞，然后冰上裂解半小时，离心。时间过长，蛋白容易降解，虽然加了PMSF。建议还可以考虑添加蛋白酶抑制剂。 5：最后，没有离心，因为感觉不浑浊，没有太多沉淀，直接移到离心管中做实验 内参是细胞中表达较强的蛋白，内参做出来目的蛋白不一定能做出来。总结楼主的问题可能出在1.裂解液过多导致蛋白浓度低。2.裂解时间过长，蛋白降解。3.未提到用细胞刮子收集，可能收集不完全。 最后，还是建议要离心，4度，12000rmp，5min |
8楼2012-05-15 09:27:06
晴天1882
木虫 (正式写手)
- 应助: 19 (小学生)
- 金币: 4077.5
- 散金: 18
- 红花: 5
- 沙发: 1
- 帖子: 647
- 在线: 424.3小时
- 虫号: 744363
- 注册: 2009-04-09
- 性别: MM
- 专业: 生物化学
9楼2012-05-15 10:26:53
wen1023tao
铜虫 (小有名气)
- BioEPI: 1
- 应助: 27 (小学生)
- 金币: 176.1
- 红花: 1
- 帖子: 82
- 在线: 20.9小时
- 虫号: 1387766
- 注册: 2011-09-02
- 性别: GG
- 专业: 植物遗传学
10楼2012-05-15 10:31:50
