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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 提取细胞蛋白
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晴天1882

木虫 (正式写手)

[求助] 提取细胞蛋白

是提取细胞中的HMGR和LDLR蛋白，然后做Western blot
HMGR：细胞内质网蛋白结合酶，LDLR：细胞膜蛋白
1：HepG2细胞培养在1640培养基中
2：一瓶细胞点六孔板，让细胞在六孔板中长24小时，细胞在孔中有时能长到80-90%，有时候长不到，但有个50-60的样子，也接着往下做
3：给不同浓度的药，换无血清培养基培养24小时
4：弃去培养基，用预冷的PBS洗三遍，直接加450ul强裂解液（含PMSF），于冰上摇晃好几个小时
5：最后，没有离心，因为感觉不浑浊，没有太多沉淀，直接移到离心管中做实验
最后做不出目的蛋白，内参能做出来，但也不是每个孔都能做出来，现在是觉得我的提取过程有问题，请大家帮忙看看我的提取步骤到底有没有问题啊？
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人有绝交，才有至交！
1楼2012-05-14 18:01:32
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gigiloveu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励发帖交流问题。 2012-05-14 21:20:07
晴天1882: 金币+1 2012-05-16 10:06:48
1.6孔板的细胞  你能提出来多少蛋白？肯定不多
2.450UL的裂解液 对于6孔板的细胞来说 太多了
3.你没离心将蛋白上清分出来
4.你定量蛋白质的时候结果如何？
我只对自己实验了解一些，可能不符合你的实验。
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2楼2012-05-14 18:58:01
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wen1023tao

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-05-14 21:20:13
晴天1882: 金币+1 2012-05-16 10:06:33
试下像细菌一样 ，直接加SDS loading buffer  沸水浴下 跑胶 western ，
western最好确定抗体好用，还有多弄点细胞，增加目的蛋白量以加强信号
还有个原因可能是背景太大，也就是杂蛋白太多 ，导致信号弱，检测不出来，裂解后可以12000或者更高转速离心下，减少杂蛋白以减少背景，做之前确定你的蛋白是在上清中，可以做的时候离心下来的沉淀也一起跑胶做，这样即使在沉淀中叶可以检测出来
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3楼2012-05-14 20:18:11
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晴天1882

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wen1023tao at 2012-05-14 20:18:11:
试下像细菌一样 ，直接加SDS loading buffer  沸水浴下 跑胶 western ，
western最好确定抗体好用，还有多弄点细胞，增加目的蛋白量以加强信号
还有个原因可能是背景太大，也就是杂蛋白太多 ，导致信号弱，检测 ...

如果沉淀中有目的蛋白，我之前都不离心的，因为沉淀不多，感觉离心后也没多少沉淀，现在我就是直接跑胶的，内参条带还是比较清楚的，就是目的条带没有
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4楼2012-05-14 21:41:52
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晴天1882

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gigiloveu at 2012-05-14 18:58:01:
1.6孔板的细胞  你能提出来多少蛋白？肯定不多
2.450UL的裂解液 对于6孔板的细胞来说 太多了
3.你没离心将蛋白上清分出来
4.你定量蛋白质的时候结果如何？
我只对自己实验了解一些，可能不符合你的实验。

请问你是怎么提取细胞蛋白的？
我也是觉得有点多，但是六孔板要加少了又怕覆盖全部的孔
我是感觉沉淀不多，也就没离心了
没有蛋白定量，但内参做出来的条带还是很清楚的
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5楼2012-05-14 21:45:41
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telomerase

至尊木虫 (著名写手)

cain
直接加450ul强裂解液（含PMSF），于冰上摇晃好几个小时

我会用细胞刮子刮，或者吹打下来，一般不晃这么久。下来超声，冰浴，离心。吸上清。 最好定个量，每孔上同样的蛋白量。  

其他的你能做出来，证明你的方法操作还是过关的。 可能是某一孔的样品量不够或提的蛋白不够多。
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我的路靠我的脚踩出来！！！不走寻常路！！！
6楼2012-05-14 22:06:56
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晴天1882

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by telomerase at 2012-05-14 22:06:56:
直接加450ul强裂解液（含PMSF），于冰上摇晃好几个小时

我会用细胞刮子刮，或者吹打下来，一般不晃这么久。下来超声，冰浴，离心。吸上清。 最好定个量，每孔上同样的蛋白量。  

其他的你能做出来，证明你的 ...

也用过你的方法，是觉得细胞刮和吹打不下细胞来，如果是细胞瓶好操作一下，但是六孔板不好操作
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7楼2012-05-15 08:42:57
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shenyang24

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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晴天1882: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-05-16 10:05:45
晴天1882: 金币+1 2012-05-16 10:07:57
1：HepG2细胞培养在1640培养基中
没有问题

2：一瓶细胞点六孔板，让细胞在六孔板中长24小时，细胞在孔中有时能长到80-90%，有时候长不到，但有个50-60的样子，也接着往下做
HepG2，肝癌细胞，生长速度很快，六孔板24h才50%融合度，怀疑传代时细胞密度过小，或细胞状态不好。

3：给不同浓度的药，换无血清培养基培养24小时
一般处理后，我都会显微镜下观察，看是否漂浮的细胞比较多。有些药物处理会杀死细胞或使细胞脱吸附。

4：弃去培养基，用预冷的PBS洗三遍，直接加450ul强裂解液（含PMSF），于冰上摇晃好几个小时
这一步问题比较大，我也做过HepG2细胞，我们一般6孔板，超过80%融合度都只加不超过150ul的裂解液。加裂解液后，直接用细胞刮子收集细胞，然后冰上裂解半小时，离心。时间过长，蛋白容易降解，虽然加了PMSF。建议还可以考虑添加蛋白酶抑制剂。

5：最后，没有离心，因为感觉不浑浊，没有太多沉淀，直接移到离心管中做实验

内参是细胞中表达较强的蛋白，内参做出来目的蛋白不一定能做出来。总结楼主的问题可能出在1.裂解液过多导致蛋白浓度低。2.裂解时间过长，蛋白降解。3.未提到用细胞刮子收集，可能收集不完全。
最后，还是建议要离心，4度，12000rmp，5min
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8楼2012-05-15 09:27:06
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晴天1882

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by shenyang24 at 2012-05-15 09:27:06:
1：HepG2细胞培养在1640培养基中
没有问题

2：一瓶细胞点六孔板，让细胞在六孔板中长24小时，细胞在孔中有时能长到80-90%，有时候长不到，但有个50-60的样子，也接着往下做
HepG2，肝癌细胞，生长速度很快， ...

说的很有道理，但是感觉六孔板加150ul裂解液少了，孔没覆盖全，怕裂解不到全部细胞，请问你是加了裂解液后直接刮细胞，我有时就是随便的挂几下，请问刮细胞的时候有没什么技巧，刮多长时间，谢谢了啊！
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9楼2012-05-15 10:26:53
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wen1023tao

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 晴天1882 at 2012-05-14 21:41:52:
如果沉淀中有目的蛋白，我之前都不离心的，因为沉淀不多，感觉离心后也没多少沉淀，现在我就是直接跑胶的，内参条带还是比较清楚的，就是目的条带没有

离心分开上清和沉淀，是为了降低杂蛋白背景干扰，提高信号强度，你可以想象一下你是容易在1000个白色珠子里发现一颗黑色的珠子，还是在100个里面发现容易些，
这些只是推测，不一定是根本原因 ，做一个参考
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10楼2012-05-15 10:31:50
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