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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 提取细胞蛋白
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晴天1882

木虫 (正式写手)

[求助] 提取细胞蛋白

是提取细胞中的HMGR和LDLR蛋白，然后做Western blot
HMGR：细胞内质网蛋白结合酶，LDLR：细胞膜蛋白
1：HepG2细胞培养在1640培养基中
2：一瓶细胞点六孔板，让细胞在六孔板中长24小时，细胞在孔中有时能长到80-90%，有时候长不到，但有个50-60的样子，也接着往下做
3：给不同浓度的药，换无血清培养基培养24小时
4：弃去培养基，用预冷的PBS洗三遍，直接加450ul强裂解液（含PMSF），于冰上摇晃好几个小时
5：最后，没有离心，因为感觉不浑浊，没有太多沉淀，直接移到离心管中做实验
最后做不出目的蛋白，内参能做出来，但也不是每个孔都能做出来，现在是觉得我的提取过程有问题，请大家帮忙看看我的提取步骤到底有没有问题啊？
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1楼 2012-05-14 18:01:32
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晴天1882

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wen1023tao at 2012-05-14 20:18:11:
试下像细菌一样 ，直接加SDS loading buffer  沸水浴下 跑胶 western ，
western最好确定抗体好用，还有多弄点细胞，增加目的蛋白量以加强信号
还有个原因可能是背景太大，也就是杂蛋白太多 ，导致信号弱，检测 ...

如果沉淀中有目的蛋白，我之前都不离心的，因为沉淀不多，感觉离心后也没多少沉淀，现在我就是直接跑胶的，内参条带还是比较清楚的，就是目的条带没有
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4楼2012-05-14 21:41:52
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gigiloveu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励发帖交流问题。 2012-05-14 21:20:07
晴天1882: 金币+1 2012-05-16 10:06:48
1.6孔板的细胞  你能提出来多少蛋白？肯定不多
2.450UL的裂解液 对于6孔板的细胞来说 太多了
3.你没离心将蛋白上清分出来
4.你定量蛋白质的时候结果如何？
我只对自己实验了解一些，可能不符合你的实验。
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2楼2012-05-14 18:58:01
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wen1023tao

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-05-14 21:20:13
晴天1882: 金币+1 2012-05-16 10:06:33
试下像细菌一样 ，直接加SDS loading buffer  沸水浴下 跑胶 western ，
western最好确定抗体好用，还有多弄点细胞，增加目的蛋白量以加强信号
还有个原因可能是背景太大，也就是杂蛋白太多 ，导致信号弱，检测不出来，裂解后可以12000或者更高转速离心下，减少杂蛋白以减少背景，做之前确定你的蛋白是在上清中，可以做的时候离心下来的沉淀也一起跑胶做，这样即使在沉淀中叶可以检测出来
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3楼2012-05-14 20:18:11
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晴天1882

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gigiloveu at 2012-05-14 18:58:01:
1.6孔板的细胞  你能提出来多少蛋白？肯定不多
2.450UL的裂解液 对于6孔板的细胞来说 太多了
3.你没离心将蛋白上清分出来
4.你定量蛋白质的时候结果如何？
我只对自己实验了解一些，可能不符合你的实验。

请问你是怎么提取细胞蛋白的？
我也是觉得有点多，但是六孔板要加少了又怕覆盖全部的孔
我是感觉沉淀不多，也就没离心了
没有蛋白定量，但内参做出来的条带还是很清楚的
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5楼2012-05-14 21:45:41
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