应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » His Tag融合蛋白纯化
91/1返回列表
查看: 2380  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

hyhl

铁杆木虫 (小有名气)

[求助] His Tag融合蛋白纯化

pET-28a/BL21表达得到目的蛋白，部分可溶，部分包涵体，使用Novagen的kit对可溶蛋白进行纯化遇到如下问题：使用BugBuster抽提试剂处理菌液后得到可用于上柱纯化的蛋白溶液置于4度保存过夜均发生沉淀，-20度冻存也出现沉淀（电泳检测过，目的蛋白就在沉淀中），这样还能继续上柱纯化可溶性蛋白吗？怎样才能使蛋白不发生沉淀？有人遇到类似的问题吗？请各位高手指点。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-09-18 15:05:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
导致蛋白沉淀的原因很多。
主要还是PH问题，不知知道你的蛋白等电点是多少，抽提试剂的PH是不是在等电点附近，所以导致沉淀。
赞一下 回复此楼
2楼2012-09-18 15:45:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hyhl

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-18 15:45:45
导致蛋白沉淀的原因很多。
主要还是PH问题，不知知道你的蛋白等电点是多少，抽提试剂的PH是不是在等电点附近，所以导致沉淀。

等电点是4.9，溶在PBS（PH7.4）里也沉淀的。还有别的可能吗？请教！
赞一下 回复此楼
3楼2012-09-19 10:30:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-09-20 15:26:41
引用回帖:
3楼: Originally posted by hyhl at 2012-09-19 10:30:53
等电点是4.9，溶在PBS（PH7.4）里也沉淀的。还有别的可能吗？请教！...

如果方便的话能不能说一下你的大致步骤，因为我不知道你的问题出在什么地方。
你的蛋白解冻后也会出现沉淀，4℃过夜也会沉淀。不知道你加了还原剂了没有，比如说DTT或者TCEP.还有，你的盐浓度是多少？
赞一下 回复此楼
4楼2012-09-19 10:35:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gufeng147kkk

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
蛋白沉淀了 肯定就不能上柱了~~~我这边纯化蛋白 缓冲液的PH都是慢慢摸索出来的~~~  大部分蛋白 用7.4的PH 是可以的~但是还是有很多不可以~
赞一下 回复此楼
5楼2012-09-20 09:20:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sarah-miao

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
考虑更改下盐酸胍的浓度看看。。。挂住之前，一般都会建议调节盐酸胍的浓度然后再挂柱子，纯化的，融合蛋白算比较好挂柱的。
赞一下 回复此楼
6楼2012-09-20 09:55:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hyhl

铁杆木虫 (小有名气)
蛋白是溶在抽提试剂里的，试剂盒提供的，含有1M NaCl，没有变性，也没加任何其他的东西，包括还原剂等。我希望得到的是可溶性的蛋白。刚刚抽提完对沉淀和上清进行电泳检测后确认目的蛋白是在上清里的，我将该上清溶液刚在冰箱里过夜，准备第二天用树脂进行纯化的，但是发现溶液里出现沉淀了。我对发生沉淀的溶液离心后的上清和沉淀进行了电泳检测，目的蛋白基本都在沉淀里，因此我认为是我的蛋白发生了沉淀。现在请各位指教有什么办法阻止沉淀的出现。不知道加些增容的试剂会不会影响后续的纯化？
赞一下 回复此楼
7楼2012-09-20 17:59:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hyhl

铁杆木虫 (小有名气)
还有，感谢各位的讨论和给予的建议！
赞一下 回复此楼
8楼2012-09-20 18:00:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xyoung88

金虫 (初入文坛)
蛋白质沉淀是个很通常的问题，也没有特别有效的方法。你可以加10-30%glycerol看看是否能缓解。实在不行，该mbp-tag.
赞一下 回复此楼
9楼2013-03-14 02:31:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 hyhl 的主题更新
91/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +11 kulium 2026-08-21 14/700 2026-08-24 02:12 by 流流伤
[基金申请] 2026国自然函评费到账 +16 羊腰板 2026-08-21 17/850 2026-08-23 23:02 by tianxiaochun
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +12 大萍1987 2026-08-20 15/750 2026-08-23 20:44 by 大萍1987
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +4 process2012 2026-08-23 5/250 2026-08-23 19:58 by jurkat.1640
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办？ +5 简单化xn 2026-08-22 10/500 2026-08-23 12:38 by 简单化xn
[基金申请] 什么时候开奖？ +9 CrisMessi 2026-08-18 10/500 2026-08-23 12:03 by 丶昵称占用
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +7 且听虎啸 2026-08-17 8/400 2026-08-22 21:55 by 医学老男孩
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +24 yaoyewhu2008 2026-08-20 26/1300 2026-08-22 17:43 by kammury
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +13 ziyangfang 2026-08-19 16/800 2026-08-22 17:08 by WH3796
[基金申请] 时间戳今天，20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 今日不放榜？网传国自然预计 8 月 27 日可查结果 +16 医学老男孩 2026-08-20 20/1000 2026-08-21 21:13 by Ldrop2023
[基金申请] 科研孤儿太难了 +17 我4大白菜 2026-08-20 18/900 2026-08-21 20:57 by zhangev
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +7 angus9576 2026-08-17 12/600 2026-08-21 13:38 by weiyin
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧？ +4 哈哈蛤？ 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[论文投稿] 投稿咨询 +5 wwm09 2026-08-17 7/350 2026-08-21 10:11 by 期刊论文帮手
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
[基金申请] 估计是周四 +3 archvillain 2026-08-18 3/150 2026-08-21 01:48 by jnhyjjm
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[基金申请] 朋友圈看到的 +6 wangzilk 2026-08-18 8/400 2026-08-19 10:55 by Haru815
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭