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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » His Tag融合蛋白纯化
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hyhl

铁杆木虫 (小有名气)

[求助] His Tag融合蛋白纯化

pET-28a/BL21表达得到目的蛋白，部分可溶，部分包涵体，使用Novagen的kit对可溶蛋白进行纯化遇到如下问题：使用BugBuster抽提试剂处理菌液后得到可用于上柱纯化的蛋白溶液置于4度保存过夜均发生沉淀，-20度冻存也出现沉淀（电泳检测过，目的蛋白就在沉淀中），这样还能继续上柱纯化可溶性蛋白吗？怎样才能使蛋白不发生沉淀？有人遇到类似的问题吗？请各位高手指点。
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1楼 2012-09-18 15:05:18
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
导致蛋白沉淀的原因很多。
主要还是PH问题，不知知道你的蛋白等电点是多少，抽提试剂的PH是不是在等电点附近，所以导致沉淀。
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2楼2012-09-18 15:45:45
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hyhl

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-18 15:45:45
导致蛋白沉淀的原因很多。
主要还是PH问题，不知知道你的蛋白等电点是多少，抽提试剂的PH是不是在等电点附近，所以导致沉淀。

等电点是4.9，溶在PBS（PH7.4）里也沉淀的。还有别的可能吗？请教！
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3楼2012-09-19 10:30:53
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-09-20 15:26:41
引用回帖:
3楼: Originally posted by hyhl at 2012-09-19 10:30:53
等电点是4.9，溶在PBS（PH7.4）里也沉淀的。还有别的可能吗？请教！...

如果方便的话能不能说一下你的大致步骤，因为我不知道你的问题出在什么地方。
你的蛋白解冻后也会出现沉淀，4℃过夜也会沉淀。不知道你加了还原剂了没有，比如说DTT或者TCEP.还有，你的盐浓度是多少？
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4楼2012-09-19 10:35:58
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gufeng147kkk

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
蛋白沉淀了 肯定就不能上柱了~~~我这边纯化蛋白 缓冲液的PH都是慢慢摸索出来的~~~  大部分蛋白 用7.4的PH 是可以的~但是还是有很多不可以~
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5楼2012-09-20 09:20:21
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sarah-miao

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
考虑更改下盐酸胍的浓度看看。。。挂住之前，一般都会建议调节盐酸胍的浓度然后再挂柱子，纯化的，融合蛋白算比较好挂柱的。
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6楼2012-09-20 09:55:45
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hyhl

铁杆木虫 (小有名气)
蛋白是溶在抽提试剂里的，试剂盒提供的，含有1M NaCl，没有变性，也没加任何其他的东西，包括还原剂等。我希望得到的是可溶性的蛋白。刚刚抽提完对沉淀和上清进行电泳检测后确认目的蛋白是在上清里的，我将该上清溶液刚在冰箱里过夜，准备第二天用树脂进行纯化的，但是发现溶液里出现沉淀了。我对发生沉淀的溶液离心后的上清和沉淀进行了电泳检测，目的蛋白基本都在沉淀里，因此我认为是我的蛋白发生了沉淀。现在请各位指教有什么办法阻止沉淀的出现。不知道加些增容的试剂会不会影响后续的纯化？
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7楼2012-09-20 17:59:41
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hyhl

铁杆木虫 (小有名气)
还有，感谢各位的讨论和给予的建议！
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8楼2012-09-20 18:00:14
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xyoung88

金虫 (初入文坛)
蛋白质沉淀是个很通常的问题，也没有特别有效的方法。你可以加10-30%glycerol看看是否能缓解。实在不行，该mbp-tag.
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9楼2013-03-14 02:31:03
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