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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » His Tag融合蛋白纯化
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hyhl

铁杆木虫 (小有名气)

[求助] His Tag融合蛋白纯化

pET-28a/BL21表达得到目的蛋白，部分可溶，部分包涵体，使用Novagen的kit对可溶蛋白进行纯化遇到如下问题：使用BugBuster抽提试剂处理菌液后得到可用于上柱纯化的蛋白溶液置于4度保存过夜均发生沉淀，-20度冻存也出现沉淀（电泳检测过，目的蛋白就在沉淀中），这样还能继续上柱纯化可溶性蛋白吗？怎样才能使蛋白不发生沉淀？有人遇到类似的问题吗？请各位高手指点。
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1楼 2012-09-18 15:05:18
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gufeng147kkk

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
蛋白沉淀了 肯定就不能上柱了~~~我这边纯化蛋白 缓冲液的PH都是慢慢摸索出来的~~~  大部分蛋白 用7.4的PH 是可以的~但是还是有很多不可以~
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5楼2012-09-20 09:20:21
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
导致蛋白沉淀的原因很多。
主要还是PH问题，不知知道你的蛋白等电点是多少，抽提试剂的PH是不是在等电点附近，所以导致沉淀。
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2楼2012-09-18 15:45:45
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hyhl

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-18 15:45:45
导致蛋白沉淀的原因很多。
主要还是PH问题，不知知道你的蛋白等电点是多少，抽提试剂的PH是不是在等电点附近，所以导致沉淀。

等电点是4.9，溶在PBS（PH7.4）里也沉淀的。还有别的可能吗？请教！
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3楼2012-09-19 10:30:53
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-09-20 15:26:41
引用回帖:
3楼: Originally posted by hyhl at 2012-09-19 10:30:53
等电点是4.9，溶在PBS（PH7.4）里也沉淀的。还有别的可能吗？请教！...

如果方便的话能不能说一下你的大致步骤，因为我不知道你的问题出在什么地方。
你的蛋白解冻后也会出现沉淀，4℃过夜也会沉淀。不知道你加了还原剂了没有，比如说DTT或者TCEP.还有，你的盐浓度是多少？
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4楼2012-09-19 10:35:58
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