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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于Hs tag 蛋白纯化后蛋白不纯的问题
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匿名

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1楼2013-04-16 01:08:43
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回帖置顶 ( 共有1个 )

auroraA

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+5, BioEPI+1, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-04-16 21:06:11
一般这种事不会发生.如果你考染看不出一条很突出的,明显强于其它band的band,说明表达不好.
极有可能是你的蛋白folding极其不好,和很多蛋白都抓到了一起,所以纯化不下来.一般这种蛋白的表达量也不会太高.lyse完反而少了,说明部分不溶.
切角回收是可以的.但是你要先知道你的蛋白的等电点,选一个合适的native gel,跑完后用ice cold 1M KCl染(但要求蛋白量达,因为sensitivity不高),把白色的band切下来,切丁,转入透析袋中(带有你想要的buffer),在DNA胶的tank里放入你需要的buffer, 把透析袋扔进去,"电泳"让蛋白跑出来,大概几个小时后就行了.
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3楼2013-04-16 07:44:45
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流！ 2013-04-16 21:06:02
确定是杂蛋白吗？western鉴定是是否识别杂带？实在不行的话可以用native-page后切带做electro elute。
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2楼2013-04-16 03:54:41
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shine372

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+1, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-04-16 21:06:19
首先你的蛋白表达量要有，其次通过改变诱导表达条件，尽量确保蛋白是可溶性表达，你的纯化初条件是怎么确定的，纯化用什么仪器来检测，都会影响最终的纯化效果
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4楼2013-04-16 11:36:31
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_小小鸟

金虫 (正式写手)

御林军

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+1, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-04-16 21:06:24
Ni柱纯化完，可以尝试用别的柱子比如DEAE，纯化是比较麻烦的，需要慢慢摸索吧
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一米阳光照大地。。。
5楼2013-04-16 20:20:34
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xissy

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by auroraA at 2013-04-16 07:44:45
一般这种事不会发生.如果你考染看不出一条很突出的,明显强于其它band的band,说明表达不好.
极有可能是你的蛋白folding极其不好,和很多蛋白都抓到了一起,所以纯化不下来.一般这种蛋白的表达量也不会太高.lyse完反而 ...

KCl的负染，250mM的浓度就可以了吧？？
另外，负染下，目的蛋白的条带是透明的，背景是白色的吧？
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6楼2015-02-01 10:07:49
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321wangke321

金虫 (正式写手)
请问，最后用的不纯蛋白做的EMSA，还是先改进了方法，进行了纯化？
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王者风范，一切皆有可能。
7楼2016-03-22 21:23:51
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