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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助：为什么Ni柱再生后纯化蛋白无活性~~~
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巢北

银虫 (初入文坛)

[求助] 求助：为什么Ni柱再生后纯化蛋白无活性~~~

我做了两次纯化，第一次用的是一个旧柱子，上柱后用梯度洗脱液洗脱，检测每个梯度洗下的酶都是有活性的。后来把柱子再生了一下，诱导表达后破碎菌体，将破碎上清检测了一下也是有活性的，但是上柱纯化透析复性之后就没活性了，这样看是柱子再生的问题吗？
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1楼 2013-04-22 09:31:52
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zhaolf

木虫 (著名写手)

胖虎爱唱歌

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 错别字不少哇菇凉哈哈。赠人玫瑰手有余香 2013-04-22 15:40:15
应该和再生没什么关系,除非你操作不当.
不过透析复性是什么意思?难道你用的变性纯化?
如果不是变形纯化, 说明很可能你的酶在高盐下,或者一定的pH时才有活性,因为你提到的有活性的情况全是高盐,或者purification buffer pH状态下的,而透析后(一般偷袭是为了除盐,且可能改变pH, 取决于你的dialysis buffer是什么),盐浓度降低,或者pH变化等,活性就没了.如果是这样,你这算是个意外的大发现
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我是胖虎，我是孩子王！
2楼2013-04-22 13:57:45
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秋水素心

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励发贴交流，为楼主问题解决提供可能的线索！ 2013-04-23 14:36:38
你是不是用了高浓度尿素溶解蛋白？
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认真过好每一天！
3楼2013-04-22 16:50:02
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巢北

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 秋水素心 at 2013-04-22 16:50:02
你是不是用了高浓度尿素溶解蛋白？

没有呀，用的是结合缓冲液……
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4楼2013-04-23 14:20:17
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renzhiq

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼主不要担心。
解决的方法很简单，再生后用25%的乙醇冲洗柱子，冲100倍柱体积，再用来纯化就好了
祝实验顺利
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5楼2013-05-01 10:29:30
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

你可以先检测一下洗脱的蛋白质的分子量与预期的是不是一样，可以做个电泳或者质谱或者分子筛层析看看。如果没什么变化那就要考虑空间构象了。可以换种切割酶试试，或者构建新的切割位点，再有在(His)6与目的蛋白质之间的肽链大约5-6氨基酸就够，最好是亲水的。可以事先用蛋白质空间构象预测软件模拟一下，不十分准确，参考一下总可以。
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6楼2013-08-07 10:59:48
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

另外需要检测：你的蛋白质是否形成了多聚体，然后可以用SDS-PAGE和非变性电泳检测一下有活性和无活性的蛋白质并对比带，同时还可以用红外、紫外、CD光谱分别测定有活性和无活性的蛋白质并对比光谱，以后就直接用光谱测定而不用电泳，这样更方便。
而且红外、紫外、CD光谱分别测定有活性和无活性的蛋白质并对比光谱本身可以提示出很多的空间结构信息。
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7楼2013-08-07 11:05:06
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

更正：6楼的回答是错的，因为楼主没有切去组蛋白标签。
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8楼2013-08-07 11:08:27
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

1.如果蛋白质是多聚体，你可以适当增减PH值或离子强度，一般地可以再次聚合。
2.考虑你的蛋白质的过柱后是否是去了关键的辅酶小分子，考虑加回去试试活性。
3.如果是旧柱子，考虑是否存在杂蛋白或者核酸污染，存在蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质-DNA相互作用，蛋白质-RNA相互作用。可以用质谱检测一下，如果杂蛋白质或者核酸污染，上柱前先充分清洗镍柱。
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9楼2013-08-07 11:13:14
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