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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助：为什么Ni柱再生后纯化蛋白无活性~~~
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巢北

银虫 (初入文坛)

[求助] 求助：为什么Ni柱再生后纯化蛋白无活性~~~

我做了两次纯化，第一次用的是一个旧柱子，上柱后用梯度洗脱液洗脱，检测每个梯度洗下的酶都是有活性的。后来把柱子再生了一下，诱导表达后破碎菌体，将破碎上清检测了一下也是有活性的，但是上柱纯化透析复性之后就没活性了，这样看是柱子再生的问题吗？
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1楼 2013-04-22 09:31:52
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

1.如果蛋白质是多聚体，你可以适当增减PH值或离子强度，一般地可以再次聚合。
2.考虑你的蛋白质的过柱后是否是去了关键的辅酶小分子，考虑加回去试试活性。
3.如果是旧柱子，考虑是否存在杂蛋白或者核酸污染，存在蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质-DNA相互作用，蛋白质-RNA相互作用。可以用质谱检测一下，如果杂蛋白质或者核酸污染，上柱前先充分清洗镍柱。
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9楼2013-08-07 11:13:14
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zhaolf

木虫 (著名写手)

胖虎爱唱歌

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 错别字不少哇菇凉哈哈。赠人玫瑰手有余香 2013-04-22 15:40:15
应该和再生没什么关系,除非你操作不当.
不过透析复性是什么意思?难道你用的变性纯化?
如果不是变形纯化, 说明很可能你的酶在高盐下,或者一定的pH时才有活性,因为你提到的有活性的情况全是高盐,或者purification buffer pH状态下的,而透析后(一般偷袭是为了除盐,且可能改变pH, 取决于你的dialysis buffer是什么),盐浓度降低,或者pH变化等,活性就没了.如果是这样,你这算是个意外的大发现
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我是胖虎，我是孩子王！
2楼2013-04-22 13:57:45
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秋水素心

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励发贴交流，为楼主问题解决提供可能的线索！ 2013-04-23 14:36:38
你是不是用了高浓度尿素溶解蛋白？
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认真过好每一天！
3楼2013-04-22 16:50:02
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巢北

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 秋水素心 at 2013-04-22 16:50:02
你是不是用了高浓度尿素溶解蛋白？

没有呀，用的是结合缓冲液……
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4楼2013-04-23 14:20:17
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