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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】有关蛋白纯化及其基因克隆的问题！请大家帮助！
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hare1212

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】有关蛋白纯化及其基因克隆的问题！请大家帮助！ 已有6人参与

请各位高手多多帮忙啊！我的问题比较多，现在实验卡住很难过啊！
我现在的实验目标是从细菌发酵液中分离纯化一种活性蛋白并克隆其基因。目前我过了DEAE Sepharse FF和G100，收集目标洗脱峰，做了SDS-PAGE，但结果是两个条带，其分子量也是比较接近的，分子量差距大约为5kD。因为不知道目标蛋白是何种蛋白质，所以我把这两个条带分别作了肽指纹图谱（PMF）鉴定，但鉴定结果的得分并不高，只有74分和75分，而且鉴定结果分别是离子通道蛋白和假定蛋白（推测其具有某种催化活性）。我想请教大家，如果以我现在的实验结果，继续克隆MAIDI-TOF鉴定出的基因并表达，再通过表达出的蛋白质做活性鉴定，是否具有足够的说服力呢？（这样做下去做不出结果的风险是否比较大？）如果不具有足够的说服力，是否需要进一步的分离纯化？可否推荐进一步分离纯化的方法？（比如柱料选择，洗脱条件，或者更新的分离纯化手段等）或者能否提供另一种思路做下去这个实验呢？
希望各位高手多多指教，菜鸟的我再次先谢过各位了！！！
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1楼 2010-06-09 22:14:47
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1214318xy

铁虫 (著名写手)
能说一下为啥做这个蛋白质？离子通道蛋白应该不在细菌发酵液里的
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7楼2010-06-10 10:28:17
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duanyongzhong

银虫 (正式写手)
hare1212(金币+1): 2010-06-09 22:40:55
路过，帮顶！
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2楼2010-06-09 22:19:39
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hare1212

金虫 (小有名气)
自己也顶一下，希望高手们多多指教啊！！！
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3楼2010-06-09 22:40:47
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人
引用回帖:
Originally posted by hare1212 at 2010-06-09 22:14:47:
请各位高手多多帮忙啊！我的问题比较多，现在实验卡住很难过啊！
我现在的实验目标是从细菌发酵液中分离纯化一种活性蛋白并克隆其基因。目前我过了DEAE Sepharse FF和G100，收集目标洗脱峰，做了SDS-PAGE，但结果 ...

偶坐等答案
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小木虫之有关部门负责人
4楼2010-06-09 23:20:54
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007xutao

木虫 (著名写手)
hare1212(金币+1): 2010-06-10 09:51:33
做一下TOFMS
先看看分子量是多少，等电点等都应该知道，然后决定进一步分离法方法，比如离子交换+凝胶，有时也可用亲和柱，再银染一下看看有无杂条带，纯了就做结构，不纯继续纯化!分子量小一点的话可选用疏水柱HPLC分一下。当然我也是生手，只做了一点点，仅供参考！
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5楼2010-06-10 07:19:39
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hare1212

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 007xutao at 2010-06-10 07:19:39:
做一下TOFMS
先看看分子量是多少，等电点等都应该知道，然后决定进一步分离法方法，比如离子交换+凝胶，有时也可用亲和柱，再银染一下看看有无杂条带，纯了就做结构，不纯继续纯化!分子量小一点的话可选用疏水柱 ...

TOF/MS做了，分子量大约36kD，用疏水柱的话能否推荐一下具体柱料？我这个蛋白是天然蛋白质，目前好像没有合适的亲和柱料。
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6楼2010-06-10 09:55:22
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hare1212

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 1214318xy at 2010-06-10 10:28:17:
能说一下为啥做这个蛋白质？离子通道蛋白应该不在细菌发酵液里的

我的菌是芽孢杆菌，在其生长到稳定期形成和释放芽孢的时候会使菌体破裂，是否有可能膜上的离子通道进入发酵液呢？我只是推测。
我这个蛋白能促进一种酶活的提高。
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8楼2010-06-10 10:36:25
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wordsworth3180

木虫 (正式写手)
hare1212(金币+1): 2010-06-10 19:56:56
是不是可以试试其他的分离纯化方法啊？比如离子交换色谱
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9楼2010-06-10 14:17:43
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hare1212

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by wordsworth3180 at 2010-06-10 14:17:43:
是不是可以试试其他的分离纯化方法啊？比如离子交换色谱

试过了啊，DEAE就是阴离子交换色谱啊，但是还是没分开啊。
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10楼2010-06-10 19:57:45
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