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巢北

银虫 (初入文坛)

[求助] 求助:为什么Ni柱再生后纯化蛋白无活性~~~

我做了两次纯化,第一次用的是一个旧柱子,上柱后用梯度洗脱液洗脱,检测每个梯度洗下的酶都是有活性的。后来把柱子再生了一下,诱导表达后破碎菌体,将破碎上清检测了一下也是有活性的,但是上柱纯化透析复性之后就没活性了,这样看是柱子再生的问题吗?
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巢北

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 秋水素心 at 2013-04-22 16:50:02
你是不是用了高浓度尿素溶解蛋白?

没有呀,用的是结合缓冲液……
4楼2013-04-23 14:20:17
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查看全部 9 个回答

zhaolf

木虫 (著名写手)

胖虎爱唱歌

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 错别字不少哇菇凉哈哈。赠人玫瑰手有余香 2013-04-22 15:40:15
应该和再生没什么关系,除非你操作不当.
不过透析复性是什么意思?难道你用的变性纯化?
如果不是变形纯化, 说明很可能你的酶在高盐下,或者一定的pH时才有活性,因为你提到的有活性的情况全是高盐,或者purification buffer pH状态下的,而透析后(一般偷袭是为了除盐,且可能改变pH, 取决于你的dialysis buffer是什么),盐浓度降低,或者pH变化等,活性就没了.如果是这样,你这算是个意外的大发现
我是胖虎,我是孩子王!
2楼2013-04-22 13:57:45
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秋水素心

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励发贴交流,为楼主问题解决提供可能的线索! 2013-04-23 14:36:38
你是不是用了高浓度尿素溶解蛋白?
认真过好每一天!
3楼2013-04-22 16:50:02
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renzhiq

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼主不要担心。
解决的方法很简单,再生后用25%的乙醇冲洗柱子,冲100倍柱体积,再用来纯化就好了
祝实验顺利
5楼2013-05-01 10:29:30
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