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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白纯化Ni-IDA柱子出现问题
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306495799

铁虫 (小有名气)

[求助] 蛋白纯化Ni-IDA柱子出现问题

本人做的重组蛋白大肠杆菌表达，用的PET28载体，包涵体进行变性复性后上柱子纯化，没有结合，并且柱子颜色变浅，不知道是不是变性复性组成有问题：
变性液：6M盐酸胍，50mM的Tris-HCl，10mM的DTT,pH8.5
复性液：500mM精氨酸，50mM的Tris-HCl，10%甘油，pH8.0，1升复性液加0.55g谷胱甘肽。
上柱子结合前用：50mM的Tris-HCl，300mM的NaCl，10mM咪唑，pH8.0洗柱子
样品结合后，用：50mM的Tris-HCl，300mM的NaCl，20mM咪唑，pH8.0洗柱子
再用：50mM的Tris-HCl，300mM的NaCl，250mM咪唑，pH8.0洗脱，用核算蛋白检测仪结果显示没结合上柱子，而且柱子颜色变浅很多，是不是那里有什么问题，还指望专家指教！多谢

默克的His-Tag蛋白纯化操作手册不推荐使用精氨酸，不知道为什么，有什么影响吗？
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也许似乎大概是，然而未必不见得
1楼 2013-05-20 08:44:29
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回帖置顶 ( 共有2个 )

stevenshi021

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-05-20 12:31:23
gyesang: 回帖置顶 2013-05-20 16:21:46
306495799: 金币+8, ★★★很有帮助 2013-05-23 11:04:37
Arg 带正电荷氨基酸，上柱子时候回将Ni的游离集团封闭掉，因此目的蛋白中的his 不能再结合上去。一般，建议上柱的之前再透析使用没有Arg的溶液，如果蛋白正确折叠后那么就算去掉Arg其一样是可溶的。
祝你好运
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5楼2013-05-20 11:07:52
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edoz1986

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-23 22:13:15
gyesang: 回帖置顶 2013-05-23 22:13:17
10mM dtt 上ni柱 天哪，ni 都被你dtt 还原了。一般2mm上镍柱的时候就会有影响。如果非要加入这么多的还原剂的话，建议用tcep  对柱子无伤害。
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9楼2013-05-22 17:24:20
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

edoz1986

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
306495799: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-05-23 11:04:19
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-23 22:13:27
精氨酸会屏蔽柱子的ni跟his标签的离子属性而导致不挂珠子，并且可把ni离子解下来。因为精氨酸在复性时用来防止分子聚集的。
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10楼2013-05-22 17:26:22
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普通回帖

longrna

新虫 (正式写手)
遇到相似的问题，求解。。。。
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伟大航线....
2楼2013-05-20 09:06:35
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会思想的芦苇

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
样品中有还原剂  不知道你的介质耐受值是多少
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3楼2013-05-20 10:23:08
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会思想的芦苇

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

另外，为什么非得复性后挂柱呢？变性条件同样可以挂柱纯化啊
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4楼2013-05-20 10:24:16
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
306495799(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-20 16:21:59
都是500mM精氨酸惹的祸，蛋白都穿透了。
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6楼2013-05-20 13:39:49
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306495799

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by stevenshi021 at 2013-05-20 11:07:52
Arg 带正电荷氨基酸，上柱子时候回将Ni的游离集团封闭掉，因此目的蛋白中的his 不能再结合上去。一般，建议上柱的之前再透析使用没有Arg的溶液，如果蛋白正确折叠后那么就算去掉Arg其一样是可溶的。
祝你好运

高浓度咪唑，或者20%究竟可以将精氨酸洗下去吗？
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也许似乎大概是，然而未必不见得
7楼2013-05-20 14:54:30
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306495799

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 306495799 at 2013-05-20 14:54:30
高浓度咪唑，或者20%究竟可以将精氨酸洗下去吗？...

高浓度咪唑，或者20%酒精可以将精氨酸洗下去吗
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也许似乎大概是，然而未必不见得
8楼2013-05-20 15:00:24
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