应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白纯化Ni-IDA柱子出现问题
211/3返回列表123下一页
查看: 3714  |  回复: 20
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

306495799

铁虫 (小有名气)

[求助] 蛋白纯化Ni-IDA柱子出现问题

本人做的重组蛋白大肠杆菌表达，用的PET28载体，包涵体进行变性复性后上柱子纯化，没有结合，并且柱子颜色变浅，不知道是不是变性复性组成有问题：
变性液：6M盐酸胍，50mM的Tris-HCl，10mM的DTT,pH8.5
复性液：500mM精氨酸，50mM的Tris-HCl，10%甘油，pH8.0，1升复性液加0.55g谷胱甘肽。
上柱子结合前用：50mM的Tris-HCl，300mM的NaCl，10mM咪唑，pH8.0洗柱子
样品结合后，用：50mM的Tris-HCl，300mM的NaCl，20mM咪唑，pH8.0洗柱子
再用：50mM的Tris-HCl，300mM的NaCl，250mM咪唑，pH8.0洗脱，用核算蛋白检测仪结果显示没结合上柱子，而且柱子颜色变浅很多，是不是那里有什么问题，还指望专家指教！多谢

默克的His-Tag蛋白纯化操作手册不推荐使用精氨酸，不知道为什么，有什么影响吗？
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累 蛋白质生物学实验经验 蛋白表达纯化与检测 实验交流
蛋白表达纯化鉴定精华

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
也许似乎大概是，然而未必不见得
1楼 2013-05-20 08:44:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有2个 )

stevenshi021

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-05-20 12:31:23
gyesang: 回帖置顶 2013-05-20 16:21:46
306495799: 金币+8, ★★★很有帮助 2013-05-23 11:04:37
Arg 带正电荷氨基酸，上柱子时候回将Ni的游离集团封闭掉，因此目的蛋白中的his 不能再结合上去。一般，建议上柱的之前再透析使用没有Arg的溶液，如果蛋白正确折叠后那么就算去掉Arg其一样是可溶的。
祝你好运
赞一下 回复此楼
5楼2013-05-20 11:07:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

edoz1986

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-23 22:13:15
gyesang: 回帖置顶 2013-05-23 22:13:17
10mM dtt 上ni柱 天哪，ni 都被你dtt 还原了。一般2mm上镍柱的时候就会有影响。如果非要加入这么多的还原剂的话，建议用tcep  对柱子无伤害。
赞一下 回复此楼
9楼2013-05-22 17:24:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

edoz1986

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
306495799: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-05-23 11:04:19
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-23 22:13:27
精氨酸会屏蔽柱子的ni跟his标签的离子属性而导致不挂珠子，并且可把ni离子解下来。因为精氨酸在复性时用来防止分子聚集的。
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2013-05-22 17:26:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

longrna

新虫 (正式写手)
遇到相似的问题，求解。。。。
赞一下 回复此楼
伟大航线....
2楼2013-05-20 09:06:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

会思想的芦苇

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
样品中有还原剂  不知道你的介质耐受值是多少
赞一下 回复此楼
3楼2013-05-20 10:23:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

会思想的芦苇

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

另外，为什么非得复性后挂柱呢？变性条件同样可以挂柱纯化啊
赞一下 回复此楼
4楼2013-05-20 10:24:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
306495799(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-20 16:21:59
都是500mM精氨酸惹的祸，蛋白都穿透了。
赞一下 回复此楼
6楼2013-05-20 13:39:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

306495799

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by stevenshi021 at 2013-05-20 11:07:52
Arg 带正电荷氨基酸，上柱子时候回将Ni的游离集团封闭掉，因此目的蛋白中的his 不能再结合上去。一般，建议上柱的之前再透析使用没有Arg的溶液，如果蛋白正确折叠后那么就算去掉Arg其一样是可溶的。
祝你好运

高浓度咪唑，或者20%究竟可以将精氨酸洗下去吗？
赞一下 回复此楼
也许似乎大概是，然而未必不见得
7楼2013-05-20 14:54:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

306495799

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 306495799 at 2013-05-20 14:54:30
高浓度咪唑，或者20%究竟可以将精氨酸洗下去吗？...

高浓度咪唑，或者20%酒精可以将精氨酸洗下去吗
赞一下 回复此楼
也许似乎大概是，然而未必不见得
8楼2013-05-20 15:00:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 306495799 的主题更新
211/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] NSFC申报书里申请人简历中代表性论著还需要在申报书最后的附件里面再上传一遍吗 20+5 NSFC2026我来了 2026-03-10 14/700 2026-03-15 23:53 by 不负韶华的虎
[考研] 化学工程321分求调剂 +5 大米饭！ 2026-03-15 5/250 2026-03-15 18:49 by a不易
[考研] 311求调剂 +3 26研0 2026-03-15 3/150 2026-03-15 09:12 by JourneyLucky
[考研] 283求调剂 +6 小楼。 2026-03-12 9/450 2026-03-14 22:15 by cfxczx2015
[考研] 297一志愿上交085600求调剂 +5 指尖八千里 2026-03-14 5/250 2026-03-14 17:26 by a不易
[考研] 211本，11408一志愿中科院277分，曾在中科院自动化所实习 +3 Losir 2026-03-12 3/150 2026-03-14 12:11 by 热情沙漠
[考研] 【0703化学调剂】-一志愿华中师范大学-六级475 +5 Becho359 2026-03-11 5/250 2026-03-14 11:35 by 哦哦123
[考研] 求调剂 +5 鹤遨予卿 2026-03-09 5/250 2026-03-14 02:44 by JourneyLucky
[考研] 085600材料与化工 326 求调剂 +5 热爱生活ing 2026-03-09 5/250 2026-03-14 02:39 by JourneyLucky
[考研] 求调剂 +3 清风问长安 2026-03-09 3/150 2026-03-14 02:15 by JourneyLucky
[考研] 材料与化工（0856）304求B区调剂 +6 邱gl 2026-03-12 7/350 2026-03-13 23:24 by 邱gl
[考研] 泣血叩求调剂恩，愿以丹心报师恩 +6 Iuruoh 2026-03-11 6/300 2026-03-13 22:06 by JourneyLucky
[考研] 求材料调剂 085600英一数二总分302 前三科235 精通机器学习 一志愿哈工大 +4 林yaxin 2026-03-12 4/200 2026-03-13 22:04 by 星空星月
[硕博家园] 085600 260分求调剂 +3 天空还下雨么 2026-03-13 5/250 2026-03-13 18:46 by 天空还下雨么
[考研] 考研调剂 +4 芬达46 2026-03-12 4/200 2026-03-13 16:04 by ruiyingmiao
[考研] 295求调剂 +3 小匕仔汁 2026-03-12 3/150 2026-03-13 15:17 by vgtyfty
[考研] 一志愿河海大学085900土木水利专硕279求调剂不挑专业 +4 SunWwWwWw 2026-03-10 8/400 2026-03-13 02:23 by SunWwWwWw
[考研] 纺织、生物、化学、材料相关专业招生了 +4 耶耶业 2026-03-09 7/350 2026-03-12 19:05 by Equinoxhua
[考研] 求调剂材料专硕293 +6 段_(:з」∠)_ 2026-03-10 6/300 2026-03-10 18:22 by ms629
[考研] 085602化工求调剂 +7 董boxing 2026-03-10 7/350 2026-03-10 17:07 by BruceLiu320
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭