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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 今天你纯化蛋白了吗？跪求柱子挂不好的原因。。。。
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分子结构

金虫 (小有名气)

[求助] 今天你纯化蛋白了吗？跪求柱子挂不好的原因。。。。 已有1人参与

最近纯化蛋白，各种柱子搞得晚上睡觉都在过柱子。。。。做过纯化的童鞋，你们懂的。。。。。。
但是最近结果总不理想，我将样品脱盐后过Hitrap Q FF柱，穿透（前两个收集管中）中有时会有酶活，然后在第7、8、9管（盐浓度是14%左右）中我的蛋白就洗下来了，这种状况让我真的有点无能为力了。都不知道是何原因，该如何改进，我升高过pH，也挂不住。
我的缓冲液：20mM tris-hcl， 2MNacl+20mMtris-hcl.
希望各位纯化专家能给我解答一下，谢谢。。。。
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永远不要为失去的感到遗憾——你没有摘到的，只是春天的一朵花，整个春天还是你的。
1楼 2012-05-31 10:04:57
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sunsicheng

金虫 (小有名气)
加油...
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让自己变得优秀....
2楼2012-05-31 10:29:25
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分子结构

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sunsicheng at 2012-05-31 10:29:25
加油...

谢谢
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永远不要为失去的感到遗憾——你没有摘到的，只是春天的一朵花，整个春天还是你的。
3楼2012-05-31 10:41:28
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zxc6884

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+3, 欢迎来微生物板块交流哦^_^ 2012-06-02 10:40:57
你样品是什么成分？细胞破碎液？硫酸铵沉淀脱盐后？还是其它？
可能是过载了，不一定是你的蛋白过载，而是其它物质结合比你蛋白结合强，导致你的样品挂柱很少。
可以试下SP、或CM阳离子交换。或者高盐条件下去过疏水柱
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4楼2012-06-01 19:10:50
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分子结构

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zxc6884 at 2012-06-01 19:10:50
你样品是什么成分？细胞破碎液？硫酸铵沉淀脱盐后？还是其它？
可能是过载了，不一定是你的蛋白过载，而是其它物质结合比你蛋白结合强，导致你的样品挂柱很少。
可以试下SP、或CM阳离子交换。或者高盐条件下去过疏 ...

纤维素酶粗酶液，经硫铵沉淀后脱盐的样品上柱。试过SP挂不上，无限郁闷中。
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5楼2012-06-01 19:30:55
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zxc6884

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
zhang8826857: 金币+2, 欢迎来微生物板块交流哦^_^ 2012-06-02 10:41:05
引用回帖:
5楼: Originally posted by 分子结构 at 2012-06-01 19:30:55
纤维素酶粗酶液，经硫铵沉淀后脱盐的样品上柱。试过SP挂不上，无限郁闷中。...

硫酸铵脱盐后有没有用氯化钡鉴定盐是否去除完全？这个酶的pH是多少？挂柱条件是什么？

如果是天然筛选的菌，这种酶有很多同工酶，有时pI值相差较大，是会出现一部分挂上，一部分没挂上。

离子交换条件很重要，有时相差一点，效果也会相差很多。
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分子结构
关注我关注的
6楼2012-06-01 23:28:01
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+1, 欢迎来微生物板块交流哦^_^ 2012-06-02 10:41:16
流程什么的说清楚一些，比如说pH多少的时候酶活力怎么分布，设定的电导率如何而实际上测得为多少。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
7楼2012-06-02 00:13:13
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mlanqiang

木虫之王 (文学泰斗)

蓝博士

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
把盐度提高一下看看吧。
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蓝精灵
8楼2012-06-02 06:22:38
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分子结构

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by zxc6884 at 2012-06-01 23:28:01
硫酸铵脱盐后有没有用氯化钡鉴定盐是否去除完全？这个酶的pH是多少？挂柱条件是什么？

如果是天然筛选的菌，这种酶有很多同工酶，有时pI值相差较大，是会出现一部分挂上，一部分没挂上。

离子交换条件很重要 ...

嗯，我试试，谢谢
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永远不要为失去的感到遗憾——你没有摘到的，只是春天的一朵花，整个春天还是你的。
9楼2012-06-02 18:05:40
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分子结构

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2012-06-02 00:13:13
流程什么的说清楚一些，比如说pH多少的时候酶活力怎么分布，设定的电导率如何而实际上测得为多少。

10楼2012-06-02 18:05:48
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