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铁虫 (小有名气)

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[求助] 蛋白纯化Ni-IDA柱子出现问题

本人做的重组蛋白大肠杆菌表达，用的PET28载体，包涵体进行变性复性后上柱子纯化，没有结合，并且柱子颜色变浅，不知道是不是变性复性组成有问题：
变性液：6M盐酸胍，50mM的Tris-HCl，10mM的DTT,pH8.5
复性液：500mM精氨酸，50mM的Tris-HCl，10%甘油，pH8.0，1升复性液加0.55g谷胱甘肽。
上柱子结合前用：50mM的Tris-HCl，300mM的NaCl，10mM咪唑，pH8.0洗柱子
样品结合后，用：50mM的Tris-HCl，300mM的NaCl，20mM咪唑，pH8.0洗柱子
再用：50mM的Tris-HCl，300mM的NaCl，250mM咪唑，pH8.0洗脱，用核算蛋白检测仪结果显示没结合上柱子，而且柱子颜色变浅很多，是不是那里有什么问题，还指望专家指教！多谢

默克的His-Tag蛋白纯化操作手册不推荐使用精氨酸，不知道为什么，有什么影响吗？

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也许似乎大概是，然而未必不见得

1楼 2013-05-20 08:44:29

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引用回帖:

5楼: Originally posted by stevenshi021 at 2013-05-20 11:07:52
Arg 带正电荷氨基酸，上柱子时候回将Ni的游离集团封闭掉，因此目的蛋白中的his 不能再结合上去。一般，建议上柱的之前再透析使用没有Arg的溶液，如果蛋白正确折叠后那么就算去掉Arg其一样是可溶的。
祝你好运

高浓度咪唑，或者20%究竟可以将精氨酸洗下去吗？