应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白纯化Ni-IDA柱子出现问题
211/3返回列表123下一页
查看: 4385  |  回复: 20
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

306495799

铁虫 (小有名气)

[求助] 蛋白纯化Ni-IDA柱子出现问题

本人做的重组蛋白大肠杆菌表达，用的PET28载体，包涵体进行变性复性后上柱子纯化，没有结合，并且柱子颜色变浅，不知道是不是变性复性组成有问题：
变性液：6M盐酸胍，50mM的Tris-HCl，10mM的DTT,pH8.5
复性液：500mM精氨酸，50mM的Tris-HCl，10%甘油，pH8.0，1升复性液加0.55g谷胱甘肽。
上柱子结合前用：50mM的Tris-HCl，300mM的NaCl，10mM咪唑，pH8.0洗柱子
样品结合后，用：50mM的Tris-HCl，300mM的NaCl，20mM咪唑，pH8.0洗柱子
再用：50mM的Tris-HCl，300mM的NaCl，250mM咪唑，pH8.0洗脱，用核算蛋白检测仪结果显示没结合上柱子，而且柱子颜色变浅很多，是不是那里有什么问题，还指望专家指教！多谢

默克的His-Tag蛋白纯化操作手册不推荐使用精氨酸，不知道为什么，有什么影响吗？
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累 蛋白质生物学实验经验 蛋白表达纯化与检测 实验交流
蛋白表达纯化鉴定精华

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
也许似乎大概是，然而未必不见得
1楼 2013-05-20 08:44:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

edoz1986

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
306495799: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-05-23 11:04:19
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-23 22:13:27
精氨酸会屏蔽柱子的ni跟his标签的离子属性而导致不挂珠子，并且可把ni离子解下来。因为精氨酸在复性时用来防止分子聚集的。
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2013-05-22 17:26:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

longrna

新虫 (正式写手)
遇到相似的问题，求解。。。。
赞一下 回复此楼
伟大航线....
2楼2013-05-20 09:06:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

会思想的芦苇

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
样品中有还原剂  不知道你的介质耐受值是多少
赞一下 回复此楼
3楼2013-05-20 10:23:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

会思想的芦苇

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

另外，为什么非得复性后挂柱呢？变性条件同样可以挂柱纯化啊
赞一下 回复此楼
4楼2013-05-20 10:24:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

stevenshi021

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-05-20 12:31:23
gyesang: 回帖置顶 2013-05-20 16:21:46
306495799: 金币+8, ★★★很有帮助 2013-05-23 11:04:37
Arg 带正电荷氨基酸，上柱子时候回将Ni的游离集团封闭掉，因此目的蛋白中的his 不能再结合上去。一般，建议上柱的之前再透析使用没有Arg的溶液，如果蛋白正确折叠后那么就算去掉Arg其一样是可溶的。
祝你好运
赞一下 回复此楼
5楼2013-05-20 11:07:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
306495799(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-20 16:21:59
都是500mM精氨酸惹的祸，蛋白都穿透了。
赞一下 回复此楼
6楼2013-05-20 13:39:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

306495799

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by stevenshi021 at 2013-05-20 11:07:52
Arg 带正电荷氨基酸，上柱子时候回将Ni的游离集团封闭掉，因此目的蛋白中的his 不能再结合上去。一般，建议上柱的之前再透析使用没有Arg的溶液，如果蛋白正确折叠后那么就算去掉Arg其一样是可溶的。
祝你好运

高浓度咪唑，或者20%究竟可以将精氨酸洗下去吗？
赞一下 回复此楼
也许似乎大概是，然而未必不见得
7楼2013-05-20 14:54:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

306495799

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 306495799 at 2013-05-20 14:54:30
高浓度咪唑，或者20%究竟可以将精氨酸洗下去吗？...

高浓度咪唑，或者20%酒精可以将精氨酸洗下去吗
赞一下 回复此楼
也许似乎大概是，然而未必不见得
8楼2013-05-20 15:00:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

edoz1986

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-23 22:13:15
gyesang: 回帖置顶 2013-05-23 22:13:17
10mM dtt 上ni柱 天哪，ni 都被你dtt 还原了。一般2mm上镍柱的时候就会有影响。如果非要加入这么多的还原剂的话，建议用tcep  对柱子无伤害。
赞一下 回复此楼
9楼2013-05-22 17:24:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 306495799 的主题更新
211/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[找工作] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 EZ67DG6CvcKL 2026-08-31 3/150 2026-08-31 22:23 by o3EMxHUAQDtS
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 EZ67DG6CvcKL 2026-08-31 3/150 2026-08-31 22:14 by o3EMxHUAQDtS
[基金申请] 基金未中，这种答复是模板吗？ +6 zhaosm1982 2026-08-27 7/350 2026-08-31 21:18 by qdxxmc
[基金申请] 能否申诉？ +7 echo8914667 2026-08-30 8/400 2026-08-31 17:00 by yihongxu
[文学芳草园] 梦想 +5 myrtle 2026-08-26 5/250 2026-08-31 14:40 by hahaboy
[基金申请] 中青基了要发朋友圈吗？ +7 349506619 2026-08-28 7/350 2026-08-31 13:39 by 冼亮淀粉酶
[基金申请] 29号明天会评吗 +4 笨笨唐 2026-08-28 4/200 2026-08-31 09:30 by huixian257
[基金申请] 为什么到现在没收到通知？ +5 tannykie 2026-08-29 5/250 2026-08-30 21:05 by purplejack
[考博] 找导师 +6 yuanjiabao 2026-08-29 7/350 2026-08-30 14:40 by 生科新手
[基金申请] 我就是申请一个面上项目而已，这评审意见是按照杰青的条件评的吧？ +6 gouxfjh 2026-08-28 11/550 2026-08-30 07:57 by gouxfjh
[基金申请] 国自然评审意见 +13 wangmingqi 2026-08-28 19/950 2026-08-29 10:22 by Poppy1104
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +12 Kittylucky 2026-08-27 13/650 2026-08-29 00:04 by superceng
[基金申请] 看板上这么多中的，有点像50人群里49个人都是骗子的那种感觉…… +5 a089 2026-08-26 6/300 2026-08-27 14:05 by jonewore
[基金申请] 我不理解！ +15 Edward_pc 2026-08-26 23/1150 2026-08-26 20:34 by zzuzxg
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +4 bjdxyxy 2026-08-26 4/200 2026-08-26 13:12 by qingmu1201
[基金申请] 项目信息和经费信息在系统里都可以看到了 +6 wittyboy 2026-08-26 14/700 2026-08-26 10:55 by wittyboy
[基金申请] 国合可查了 +3 paperzjh 2026-08-26 3/150 2026-08-26 10:41 by LemmonTr
[基金申请] 今天务委会开完了，明天出结果吗 +19 angus9576 2026-08-25 23/1150 2026-08-26 10:03 by zp519
[基金申请] 在坚冰还盖着北海的时候，我看到了怒放的梅花。 (金币+10) +6 ziyangfang 2026-08-25 9/450 2026-08-25 20:26 by huagongfeihu
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭