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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白纯化Ni-IDA柱子出现问题
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306495799

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by edoz1986 at 2013-05-22 17:24:20
10mM dtt 上ni柱 天哪，ni 都被你dtt 还原了。一般2mm上镍柱的时候就会有影响。如果非要加入这么多的还原剂的话，建议用tcep  对柱子无伤害。

我的蛋白是变性液溶解的沉淀，后1:20加入复性液中，再过柱子的
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也许似乎大概是，然而未必不见得
11楼2013-05-23 09:07:14
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edoz1986

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-23 22:13:48
引用回帖:
11楼: Originally posted by 306495799 at 2013-05-23 09:07:14
我的蛋白是变性液溶解的沉淀，后1:20加入复性液中，再过柱子的...

复性液中有多少dtt？
复性是否成功呢？
可以取少量复性蛋白透析到8m尿素中再挂镍柱，看看是否挂。如果挂的话就是你的复性没成功，或者复性后你的6个his被折叠到分子内部去了。
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12楼2013-05-23 10:03:18
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stevenshi021

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-23 22:13:56
这与你洗下去没有关系，你的arg会剥落你的Ni，一般上柱子之前需要透析掉Arg。
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13楼2013-05-23 10:18:49
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306495799

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by edoz1986 at 2013-05-23 10:03:18
复性液中有多少dtt？
复性是否成功呢？
可以取少量复性蛋白透析到8m尿素中再挂镍柱，看看是否挂。如果挂的话就是你的复性没成功，或者复性后你的6个his被折叠到分子内部去了。...

8M尿素岂不是又变性了吗？怎么能反映出复性的效果？求解？
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也许似乎大概是，然而未必不见得
14楼2013-05-23 16:37:48
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306495799

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by stevenshi021 at 2013-05-23 10:18:49
这与你洗下去没有关系，你的arg会剥落你的Ni，一般上柱子之前需要透析掉Arg。

那我的柱子岂不是要再生才能使用啊
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也许似乎大概是，然而未必不见得
15楼2013-05-23 16:38:20
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edoz1986

新虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 306495799 at 2013-05-23 16:37:48
8M尿素岂不是又变性了吗？怎么能反映出复性的效果？求解？...

取少量，只是为了验证
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16楼2013-05-23 20:07:04
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929519755

金虫 (正式写手)
你变性的时候 为什么不用尿素？我不知道你的Ni-IDA是什么牌子的，我曾经用过国产的Ni-IDA用盐酸胍变性时发现Ni柱变颜色了，也未纯化到蛋白。最后发现，盐酸胍性质过于剧烈，国产的Ni-IDA受不了。建议用尿素作为变性剂……
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想你没话说
17楼2013-08-16 10:49:45
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Allen206

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by edoz1986 at 2013-05-22 17:24:20
10mM dtt 上ni柱 天哪，ni 都被你dtt 还原了。一般2mm上镍柱的时候就会有影响。如果非要加入这么多的还原剂的话，建议用tcep  对柱子无伤害。

您好，请问tcep是什么？特殊填料么？
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不想说什么，，，，
18楼2013-12-11 16:06:35
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Allen206

银虫 (小有名气)
DTT不行，太高了，用1MM
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不想说什么，，，，
19楼2013-12-11 16:07:21
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glcmu

木虫 (小有名气)
引用回帖:
19楼: Originally posted by Allen206 at 2013-12-11 16:07:21
DTT不行，太高了，用1MM

你好，我的DTT就是1mM的，可是也出现问题了，刚平衡，组织就变颜色了，棕黄棕黄的，那柱子只有再生了？
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20楼2014-06-18 15:21:11
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