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lu78wi

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于pET32a的HIS标签

pET32a中有2个His标签,我将我的序列插入他们之间,可是由于疏忽把下游的终止密码子没有去掉,使与我要表达蛋白下游紧邻的his不能表达,这样会不会造成后期蛋白纯化困难,我是要制备多抗。我要不要现在就重新设计下游引物?
谢谢前辈们。
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by lu78wi at 2013-03-08 16:54:05
我的蛋白是要为后续做多抗用的,那判断这个蛋白是否是我需要的目的蛋白只能通过看电泳后大小呢?...

一般是比较诱导前后的表达差异。多数情况下,电泳条带的分子量应该与理论值相差不远。
10楼2013-03-09 01:18:53
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普通回帖

无为书生

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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只要表达带有一个His标签就能够纯化的。
2楼2013-03-08 10:50:03
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
一般都是带一个his tag的,载体上有两个是方便克隆的,没必要都留着。
3楼2013-03-08 11:25:04
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lu78wi

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-08 11:25:04
一般都是带一个his tag的,载体上有两个是方便克隆的,没必要都留着。

那对纯化效率影响会不会很大?
4楼2013-03-08 11:52:00
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hellolin

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
引用回帖:
4楼: Originally posted by lu78wi at 2013-03-08 11:52:00
那对纯化效率影响会不会很大?...

基本对纯化没什么影响
scienceguy
5楼2013-03-08 14:41:07
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
如果你是用pET32a的话,那么下游表达出来的不是His6,而是其它的氨基酸,它是有移码的。
6楼2013-03-08 15:03:25
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
lu78wi: 金币+2 2013-03-09 21:53:47
引用回帖:
4楼: Originally posted by lu78wi at 2013-03-08 11:52:00
那对纯化效率影响会不会很大?...

理论上两个tag可能与柱子结合更紧,实际操作上要看标签是暴露在蛋白表面还是包埋在内部。是否可以纯化到蛋白要等做出表达后实验得知。
7楼2013-03-08 15:33:56
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lu78wi

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-08 15:33:56
理论上两个tag可能与柱子结合更紧,实际操作上要看标签是暴露在蛋白表面还是包埋在内部。是否可以纯化到蛋白要等做出表达后实验得知。...

我的蛋白是要为后续做多抗用的,那判断这个蛋白是否是我需要的目的蛋白只能通过看电泳后大小呢?
8楼2013-03-08 16:54:05
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lu78wi

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by hellolin at 2013-03-08 14:41:07
基本对纯化没什么影响...

好,谢谢
9楼2013-03-08 16:55:14
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