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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于pET32a的HIS标签
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lu78wi

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于pET32a的HIS标签

pET32a中有2个His标签，我将我的序列插入他们之间，可是由于疏忽把下游的终止密码子没有去掉，使与我要表达蛋白下游紧邻的his不能表达，这样会不会造成后期蛋白纯化困难，我是要制备多抗。我要不要现在就重新设计下游引物？
谢谢前辈们。
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1楼 2013-03-08 10:30:55
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by lu78wi at 2013-03-08 16:54:05
我的蛋白是要为后续做多抗用的，那判断这个蛋白是否是我需要的目的蛋白只能通过看电泳后大小呢？...

一般是比较诱导前后的表达差异。多数情况下，电泳条带的分子量应该与理论值相差不远。
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10楼2013-03-09 01:18:53
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普通回帖

无为书生

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
只要表达带有一个His标签就能够纯化的。
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2楼2013-03-08 10:50:03
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般都是带一个his tag的，载体上有两个是方便克隆的，没必要都留着。
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3楼2013-03-08 11:25:04
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lu78wi

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-08 11:25:04
一般都是带一个his tag的，载体上有两个是方便克隆的，没必要都留着。

那对纯化效率影响会不会很大？
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4楼2013-03-08 11:52:00
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hellolin

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
4楼: Originally posted by lu78wi at 2013-03-08 11:52:00
那对纯化效率影响会不会很大？...

基本对纯化没什么影响
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scienceguy
5楼2013-03-08 14:41:07
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果你是用pET32a的话，那么下游表达出来的不是His6，而是其它的氨基酸，它是有移码的。
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6楼2013-03-08 15:03:25
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
lu78wi: 金币+2 2013-03-09 21:53:47
引用回帖:
4楼: Originally posted by lu78wi at 2013-03-08 11:52:00
那对纯化效率影响会不会很大？...

理论上两个tag可能与柱子结合更紧，实际操作上要看标签是暴露在蛋白表面还是包埋在内部。是否可以纯化到蛋白要等做出表达后实验得知。
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7楼2013-03-08 15:33:56
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lu78wi

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-08 15:33:56
理论上两个tag可能与柱子结合更紧，实际操作上要看标签是暴露在蛋白表面还是包埋在内部。是否可以纯化到蛋白要等做出表达后实验得知。...

我的蛋白是要为后续做多抗用的，那判断这个蛋白是否是我需要的目的蛋白只能通过看电泳后大小呢？
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8楼2013-03-08 16:54:05
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lu78wi

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hellolin at 2013-03-08 14:41:07
基本对纯化没什么影响...

好，谢谢
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9楼2013-03-08 16:55:14
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