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seasonin银虫 (小有名气)
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[求助]
带HIS-tag标签蛋白过NI-NDA挂不上柱子
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| 带HIS-tag标签蛋白过NI-NDA挂不上柱子，在流出液里有目的条带，我尝试过跑分子筛，可是每次做细胞实验量太少了，可不可以跑NATIVE-PAGE回收目的带？还是真要在柱上做变性复性？ |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
seasonin: 金币+4 2013-04-18 17:21:32
wizardfan: 金币+2, 谢谢分享经验 2013-04-19 08:10:35
感谢参与，应助指数 +1
seasonin: 金币+4 2013-04-18 17:21:32
wizardfan: 金币+2, 谢谢分享经验 2013-04-19 08:10:35
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挂不上柱还是比较常见的，有可能蛋白折叠的时候把his tag包裹住了，分子上你可以考虑换个tag，譬如GST等比较大的tag；如果现在是N端His，你可以考虑换到C端，分子上面的方法应该是会有帮助的。 如果分子上不方便改变的话，首先western验证你看到的条带是不是你要的，如果是，考虑用离子柱去做，就当tag不存在吧。离子柱需要摸索条件，想要比较纯的，也是要看蛋白的性质了。。。。（变性一般不推荐，因为复性是世界难题，这个得看脸的。） |
2楼2013-04-18 15:17:44
qqxs
木虫 (正式写手)
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3楼2013-04-19 12:34:04
wolfman840
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4楼2013-04-19 14:24:40
5楼2013-04-21 08:55:14
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
wizardfan: 金币+5, 应助指数+1, 谢谢分析，补上应助指数 2013-04-22 07:31:10
seasonin: 金币+2 2013-04-25 16:04:55
wizardfan: 金币+5, 应助指数+1, 谢谢分析，补上应助指数 2013-04-22 07:31:10
seasonin: 金币+2 2013-04-25 16:04:55
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这种情况有一下几个原因： 首先要看用的什么表达系统，要是原核的话就是因为蛋白自身三级结构的折叠阻碍了His tag的暴露；要是用的是真核表达系统比如哺乳动物表达系统的话，除了上面的原因之外还有可能是因为蛋白糖基化的影响。这时候解决的办法有一下几个： 1 首先是分子克隆的办法，将你的蛋白和tag之间带上linker，如果不知道多长的合适的话可以尝试三种不同长度的linker，后面带上除了his以外的其他protein tag,后面再带上8*his。双重tag保证应该不会错。可以先小量转染/转化试一下，用100NI填料对应1ml supernatant 或者更多小试一下。 2 就是麻烦一点办法，就是买beads,用抗体包被beads,通过免疫结合的办法将你的蛋白纯化出来。 两种方法都会很快有结果。希望对你有所帮助！ |
6楼2013-04-21 22:33:09