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weizhi111至尊木虫 (正式写手)
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HIS标签的蛋白不挂柱，求助
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我表达的蛋白纯化时蛋白出现在穿透液里，还比较浓，附件中的胶图从左向右第6个泳道是穿透液，第7，8，9是洗脱下来的蛋白，最后一个泳道是洗脱完后柱子上残余的（我可能没有洗脱完全）。穿透液中损失掉的占了大部分， 是因为蛋白挂柱不好吗？有什么方法改进一下吗？说明：我的蛋白是在包涵体中的，我用了8M尿素水溶液过夜溶解，第二天抽滤才上样的。banding buffer中含有10mM咪唑，洗脱液含有500mM咪唑，这两种buffer中都加了8M尿素，pH=8.0。总共7ml 样品用了2ml填料。我后来把穿透液重新又用bangding buffe混合，分成了3个柱子（重新加了填料）又过了一遍（摇床上混了好几个小时），洗脱下来的还是很少。求各位有经验的大侠指教！ chunhua brm-3-29.jpg |
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 蛋白表达纯化与检测 |
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2楼2013-03-31 00:40:54
weizhi111
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4楼2013-03-31 09:38:18
weizhi111
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我今天刚录入好，回答别人的一个类似问题，顺便贴在此处，以供参考。 目的蛋白没有挂在亲和柱上，可能有四种情况，原因与解决方法如下： 第一种情况：目的蛋白的(His)6标签在重折叠时没有位于蛋白质分子的表面上，或者由于临近的空间的一个或者多个氨基酸的空间位阻阻碍了(His)6与Ni形成螯合的共价键。但是一般情况下，带有（组氨酸）6标签的蛋白质与树脂的结合并不需要蛋白质具有任何功能型结构，即使存在强变性试剂存在时也如此。 不过可能比较少的时候蛋白质的折叠形态发生了改变会隐藏（组氨酸）6标签，而使得蛋白质无法挂柱。这与存在强变性试剂时（组氨酸）6标签无法隐藏并不矛盾，因为有强变性试剂时蛋白质的肽链一般呈伸展状态，而（组氨酸）6亲水性强，且有一定刚性，所以其结和Ni形成螯合的共价键不会有太大的空间位阻。但是如果（组氨酸）6被包括在蛋白质分子之中，那则另当别论了。这样的包裹（组氨酸）6不是不可能形成。 因为比毕竟在一级结构上加了（组氨酸）6标签，一般构建时除了在（组氨酸）6与目的蛋白质之间留有凝血酶等酶切位点外，适当的还要留下几个亲水的氨基酸残基的空档，以免影响目的蛋白质的正常折叠。因为根据蛋白质折叠的拼图”模型（Jigsaw model）：组成蛋白质的绝大多数氨基酸决定其折叠，替换其中的少数（≤5%）的氨基酸残基，蛋白质折叠形成的最终构象不会发生改变 Jigsaw model可能有三种叙述： a. 每一种蛋白质可以有不同的折叠路径，2003年S. Giant 等.报道：Cytochrome C551有平行的折叠路径。 b.组成蛋白质的绝大多数氨基酸决定其折叠，替换其中的少数（≤5%）的氨基酸残基，蛋白质折叠形成的最终构象不会发生改变。 c.组成蛋白质的氨基酸中那些处于疏水核中的氨基酸残基，与其邻近的其他的氨基酸残基的电荷相互作用和空间楔合，对于蛋白质的折叠和构象稳定性起到了决定性作用。第二种情况：你用buffer不适合目的蛋白的(His)6与Ni形成螯合的共价键。 第二种情况是溶液环境的影响了蛋白质的折叠形态，使得目的蛋白的(His)6标签在折叠时没有位于蛋白质分子的表面上。影响因素：如pH，离子强度，其他蛋白质分子，缓冲溶液类型，有关影响蛋白质分子表面的试剂等。 以上两种情况的解决方法：增加所提的蛋白质样品的溶解度，楼主可考虑一下：比如适量增加变性试剂浓度或类型使得蛋白质的肽链松散开暴露出（组氨酸）6标签。另外，还可以加大离子型、非离子型或两性离子表面活性剂的浓度或类型，加大DTT浓度（DTT浓度<1mmol/L，否则DTT会与Ni2+结合），适当调整调高盐浓度（氯化钠溶液低于2mol/L，从低浓度到高浓度逐渐分梯度上升），总之，作用就是增加蛋白质的可溶性，因为（组氨酸）6的亲水性较强，增加可溶性之后（组氨酸）6容易暴露在水相。加大DTT浓度也可以切断二硫键使得蛋白质的肽链松散，进而使（组氨酸）6容易暴露在水相。 第三种情况，有比邻的组氨酸的污染蛋白质与Ni-NTA柱结合，而使得带有(His)6标签的目的蛋白没有了结合位点。第三种情况的解决方法：通过降低洗脱液pH值使得His质子化而使得污染蛋白质从层析住上被洗脱，一般有比邻的组氨酸的污染蛋白质不太可能有(His)6的序列，所以逐渐降低洗脱液pH值时，比邻的组氨酸的污染蛋白质会先被洗脱，而带有(His)6标签的目的蛋白会后被洗脱下来。即使这样估计错了，但是至少我们能够确定：有(His)6的序列的目的蛋白质与不带有有(His)6的序列的污染蛋白质被洗脱下来的pH值肯定不一样，所以可以多分些pH值洗脱，对应不同的洗脱峰我们总可以得到目的蛋白质。如果污染蛋白质含量大，而目的蛋白质含量小，可以分别将收集的洗脱产物再次过柱，当然要鉴定那个样品才是目的蛋白质，只要用那一批样品再次过柱。 第四种可能，一些蛋白质或DNA与带有(His)6标签的目的蛋白发生了非特异性相互作用，而使得带有(His)6标签的目的蛋白因为空间位阻或(His)6标签被遮盖而无法与Ni-NTA柱结合。这是可以用低浓度的去污剂(浓度不大于2%的Triton X-100或浓度不大于0.5%SDS)洗涤样品（上样洗脱时）；增加洗脱液的盐浓度（氯化钠溶液低于2mol/L）；上样液里加入30%-50%的甘油，已减弱疏水相互作用。 |
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weizhi1116楼2013-05-06 20:09:33
weizhi111
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