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shizishanshang至尊木虫 (职业作家)
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[求助]
请问His-tag（组氨酸标签）怎么加到我的蛋白上去？ 已有1人参与
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大家好，我实验过程中需要做几个抗体（这些是一抗），向老外咨询制作过程，回信说 The best is to subclone the hydrophilic loop of A proteins or cytoplasmic region of B proteins, express in the E. coli with His-tag, purify the protein and send it for immunization in Rabbit or Rat or Mouse. 因为我做的是两大类蛋白，姑且以A和B代替。 我看老外的意思是要我分别克隆一段特殊的序列（这个序列我知道，就是我的蛋白的其中一段），然后加上 His-tag（组氨酸标签）在E. coli 中表达，然后再提取纯化蛋白后在兔子或老鼠中获得抗体？ 这中间有个问题，怎么加上 His-tag（组氨酸标签）？是直接设计引物引进 His-tag（组氨酸标签），还是按照有些人说的转到PET-30a这样还有 His-tag（组氨酸标签）的载体上获得？ 请问有没有同学做过加 His-tag（组氨酸标签）的实验啊，请指教啊！ [ Last edited by silicare on 2014-3-28 at 14:03 ] |
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muchong5577
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【答案】应助回帖
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6楼的方法不对。 pET系列的载体有些是专门能提供某些标签的融合表达，如pET30a，多克隆位点上从上到下分别有His-Tag、S-Tag、His-Tag。在每个这些标签的中间都有酶切位点，如果你表达的蛋白想带上某个标签，你只要根据质粒图谱设计引物就行，不需要在引物上加所带标签的序列，简而言之，就是利用载体本身的标签。比如，你想使用pET30a带上His-Taq，你的上游引物可设计从5端有NdeI 的酶切位点，下游引物设计为S-Tag标签后，His-Tag标签前这段序列中有的酶切位点，不过建议还是采用XhoI ，因为这样表达出蛋白最短。另外要注意的是，引物设计的时候要考虑到翻译，不要造成移码突变。 |
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