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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 组氨酸结合镍柱问题
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flll2014

铜虫 (小有名气)

[交流] 组氨酸结合镍柱问题已有5人参与

请问下大家，我的目的蛋白里面中间有两个组氨酸，但是离的特别远，会结和在镍柱上面吗？一般的组氨酸标签不是六个组氨酸标签吗？为什么我的目的蛋白也会结合在柱子上呢？
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1楼2014-08-24 22:48:49
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salanero2000

新虫 (初入文坛)
★
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能结合Ni应该是好事吧？
并不是说6个His都存在才能和Ni结合，只是为了保障有His暴露在外端。
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2楼2014-08-27 10:09:59
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flll2014

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by salanero2000 at 2014-08-27 10:09:59
能结合Ni应该是好事吧？
并不是说6个His都存在才能和Ni结合，只是为了保障有His暴露在外端。

不是，我打算去his标签的，如果目的蛋白结合在镍柱上的话，那就没办法得到我的蛋白质了
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3楼2014-08-27 10:56:01
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salanero2000

新虫 (初入文坛)
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3楼: Originally posted by flll2014 at 2014-08-27 10:56:01
不是，我打算去his标签的，如果目的蛋白结合在镍柱上的话，那就没办法得到我的蛋白质了...

去His标签是不是需要看你目的蛋白和纯化标签之间是否存在酶切位点？
另外目的蛋白结合Ni柱洗脱不久不是可以得到你的蛋白质了吗？
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4楼2014-09-01 11:16:55
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flll2014

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by salanero2000 at 2014-09-01 11:16:55
去His标签是不是需要看你目的蛋白和纯化标签之间是否存在酶切位点？
另外目的蛋白结合Ni柱洗脱不久不是可以得到你的蛋白质了吗？...

纯化标签和目的蛋白之间本来就有酶切位点，我是直接拿酶去切his标签的，切完之后，重新挂柱，正常的应该是标签挂柱，目的蛋白流穿，但是现在的情况是标签和蛋白都结合在柱子上了。用高浓度咪唑洗脱后既有标签又有目的蛋白，还有没切完全的融合蛋白，这样的话就没法分离出目的蛋白了
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5楼2014-09-02 20:52:48
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zlee

金虫 (小有名气)
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His 标签很小，你应该可以通过分子筛把它除去。
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6楼2014-09-03 17:21:19
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flll2014

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zlee at 2014-09-03 17:21:19
His 标签很小，你应该可以通过分子筛把它除去。

我的His标签很大
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7楼2014-09-04 10:13:40
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雨天放风筝22

新虫 (初入文坛)
★
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两个His与Ni形成的离子交换作用力很弱的，何况空间结构离得很远，我做过离得较近的5个不连续His结合Ni，结合的效果都不太好呢
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8楼2014-09-04 10:36:20
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1020490511

银虫 (小有名气)
★
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问一下楼主，你用的A液和B液分别是什么？我的重组his标签蛋白挂不上柱子，不知原因。谢谢！

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9楼2014-09-04 10:49:09
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flll2014

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 1020490511 at 2014-09-04 10:49:09
问一下楼主，你用的A液和B液分别是什么？我的重组his标签蛋白挂不上柱子，不知原因。谢谢！

我用的是说明书上提供的缓冲液，20mM 咪唑平衡buffer,40mM 咪唑洗杂buffer,300mM 咪唑洗脱buffer。配方是50mM NaH2po4,300mM Nacl ,分别再加入不同浓度的咪唑，PH 7.4。不过不同蛋白质用的缓冲液不同，我之前用的Tris缓冲液纯化效果就很差，你得摸索下，PH影响还是挺大的。
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10楼2014-09-04 11:51:54
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