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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于组氨酸标签 洗脱 问题
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viki_MDK

银虫 (正式写手)

[求助] 关于组氨酸标签 洗脱 问题

如果表达的蛋白两端都有组氨酸标签的话，，洗脱时容易洗脱吗，，根只有一个组氨酸标签比，，洗脱条件要如何变化？
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1楼 2012-10-13 15:30:43
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 鼓励发帖交流 2012-10-14 07:30:54
一般蛋白上只带一个标签，N-terminal或者C-terminal。如果带两个标签，洗脱一般会比带一个所需要的咪唑/histidine的浓度要高一些。这只是一般而论，任何一个his-tag的蛋白的最佳洗脱浓度并非完全相同，你需要自己做一个洗脱梯度来确定。
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2楼2012-10-13 15:42:56
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linxt2005

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不知楼主在表达的蛋白两端构建同一种融合标签的目的是什么？
从纯化的角度，正如楼上所说的，可以通过一些测试来确定实验的条件，比如可以先用连续梯度（咪唑浓度0~500mM）进行洗脱，
根据实验结果再进行优化。
如果结合比较牢固的话，可以采用降低pH值的方法来洗脱，当然要考虑目标蛋白的耐受范围。
从构建的角度，理论上讲，两端带同一种亲和标签，进行亲和纯化时，会有3种情况，
1 不结合；2 一端结合；3 两端都结合。   这主要与蛋白的构象有关，同时也受实验环境比如盐浓度等的影响。
如果出发点是想让蛋白两端都结合而提高结合强度的话，
感觉效果不一定明显，而且还有可能影响蛋白的空间构型。
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小兵一个
3楼2012-10-16 12:08:42
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viki_MDK

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by linxt2005 at 2012-10-16 12:08:42
不知楼主在表达的蛋白两端构建同一种融合标签的目的是什么？
从纯化的角度，正如楼上所说的，可以通过一些测试来确定实验的条件，比如可以先用连续梯度（咪唑浓度0~500mM）进行洗脱，
根据实验结果再进行优化。
...

为什么会不结合呢？理论上不是应该结合的更牢固吗？
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4楼2012-10-16 12:28:16
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viki_MDK

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-13 15:42:56
一般蛋白上只带一个标签，N-terminal或者C-terminal。如果带两个标签，洗脱一般会比带一个所需要的咪唑/histidine的浓度要高一些。这只是一般而论，任何一个his-tag的蛋白的最佳洗脱浓度并非完全相同，你需要自己做 ...

我表达的蛋白在上清中，并且含量很高，，我上捏住后，用500mM咪唑洗脱，发现并没有洗脱峰，，只有咪唑本生的吸收峰，因此我判断是没结合上去，我就是好奇为什么我两端都有标签反而不结合了呢？
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5楼2012-10-16 12:30:29
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by viki_MDK at 2012-10-16 12:30:29
我表达的蛋白在上清中，并且含量很高，，我上捏住后，用500mM咪唑洗脱，发现并没有洗脱峰，，只有咪唑本生的吸收峰，因此我判断是没结合上去，我就是好奇为什么我两端都有标签反而不结合了呢？...

500mM的咪唑洗脱算是浓度很高了。确定目标是否和镍柱结合可以把上柱前，flow through，和洗脱样品做个anti-His的Western。有些时候表达的蛋白的确挂不上柱，有可能是his-tag没有暴露在外面，特别是如果你的目标蛋白形成复杂的四级结构，例如多亚基复合体。你是否做了目标蛋白的这方面分析？
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6楼2012-10-16 12:57:51
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viki_MDK

银虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-16 12:57:51
500mM的咪唑洗脱算是浓度很高了。确定目标是否和镍柱结合可以把上柱前，flow through，和洗脱样品做个anti-His的Western。有些时候表达的蛋白的确挂不上柱，有可能是his-tag没有暴露在外面，特别是如果你的目标蛋白 ...

没做western，但是应该确定蛋白是表达了的。我头尾都有标签，，不会两个标签都包埋在内部吧，，这概率太小了吧。
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7楼2012-10-16 13:29:19
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by viki_MDK at 2012-10-16 13:29:19
没做western，但是应该确定蛋白是表达了的。我头尾都有标签，，不会两个标签都包埋在内部吧，，这概率太小了吧。...

我知到两个tag都包起来的概率很小的。没做western你又是怎么确定蛋白有表达的？是跑粗提看到表达蛋白的带了？
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8楼2012-10-17 06:49:52
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viki_MDK

银虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-17 06:49:52
我知到两个tag都包起来的概率很小的。没做western你又是怎么确定蛋白有表达的？是跑粗提看到表达蛋白的带了？...

是的，破碎上清液中明显看到有蛋白被诱导出来的，应该就是我表达的蛋白么。
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9楼2012-10-17 09:20:02
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by viki_MDK at 2012-10-17 09:20:02
是的，破碎上清液中明显看到有蛋白被诱导出来的，应该就是我表达的蛋白么。...

诱导出的蛋白分子量对不对？有没有做空载体的对照？
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10楼2012-10-17 11:37:45
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