3楼: Originally posted by linxt2005 at 2012-10-16 12:08:42
不知楼主在表达的蛋白两端构建同一种融合标签的目的是什么？
从纯化的角度，正如楼上所说的，可以通过一些测试来确定实验的条件，比如可以先用连续梯度（咪唑浓度0~500mM）进行洗脱，
根据实验结果再进行优化。
...

2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-13 15:42:56
一般蛋白上只带一个标签，N-terminal或者C-terminal。如果带两个标签，洗脱一般会比带一个所需要的咪唑/histidine的浓度要高一些。这只是一般而论，任何一个his-tag的蛋白的最佳洗脱浓度并非完全相同，你需要自己做 ...

5楼: Originally posted by viki_MDK at 2012-10-16 12:30:29
我表达的蛋白在上清中，并且含量很高，，我上捏住后，用500mM咪唑洗脱，发现并没有洗脱峰，，只有咪唑本生的吸收峰，因此我判断是没结合上去，我就是好奇为什么我两端都有标签反而不结合了呢？...

6楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-16 12:57:51
500mM的咪唑洗脱算是浓度很高了。确定目标是否和镍柱结合可以把上柱前，flow through，和洗脱样品做个anti-His的Western。有些时候表达的蛋白的确挂不上柱，有可能是his-tag没有暴露在外面，特别是如果你的目标蛋白 ...

7楼: Originally posted by viki_MDK at 2012-10-16 13:29:19
没做western，但是应该确定蛋白是表达了的。我头尾都有标签，，不会两个标签都包埋在内部吧，，这概率太小了吧。...

8楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-17 06:49:52
我知到两个tag都包起来的概率很小的。没做western你又是怎么确定蛋白有表达的？是跑粗提看到表达蛋白的带了？...

9楼: Originally posted by viki_MDK at 2012-10-17 09:20:02
是的，破碎上清液中明显看到有蛋白被诱导出来的，应该就是我表达的蛋白么。...