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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】组氨酸标签的设计
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xiuxiu190318

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】组氨酸标签的设计 已有4人参与

我要表达的蛋白序列需要加一个组氨酸标签，方便后面的分离纯化，请问我该怎么加？分离纯化后对标签进行切割常用的酶切位点又是怎样的呢？（最好能举例说明，非常感谢）
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路在脚下！
1楼 2010-08-20 22:22:53
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
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His-tag-DDDDK-目标蛋白，用肠激酶酶切。
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2楼2010-08-21 08:27:38
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xiuxiu190318

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2010-08-21 08:27:38:
His-tag-DDDDK-目标蛋白，用肠激酶酶切。

那可不可以加在C端呢，这个有没有什么判断的依据？我看到有人设计的序列是
ATG GGA TTA TTT CGC  CAT CAT CAC CAT CAC CAT  CGA AAA GGG. . . . . .用的是胰酶切的，胰酶和DK酶切哪一个更好呢？在其之前的氨基酸有没有什么作用？
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路在脚下！
3楼2010-08-21 09:03:28
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月月大可

木虫 (著名写手)
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His在N段还是在C段要看你的看蛋白来决定。
就我目前的经验来看多数在N段的都设计有蛋白酶切位点，而C段的都直接加入终止密码子不要了。His标签也无需自己加，你可以选择两端都带标签的，比如pET28，上游使用Nco I 就不会在N段有标签了。下游引物不要加终止密码子，同时引入蛋白酶切点。什么酶看你自己选择了。有4度切的Thrombin就不错，TEV Pre都行。酶切的buffer也多少有些差别，自己选择吧
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4楼2010-08-21 09:40:34
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xiuxiu190318

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2010-08-21 09:40:34:
His在N段还是在C段要看你的看蛋白来决定。
就我目前的经验来看多数在N段的都设计有蛋白酶切位点，而C段的都直接加入终止密码子不要了。His标签也无需自己加，你可以选择两端都带标签的，比如pET28，上游使用Nco  ...

我是要用全合成的方法合成基因序列，而载体上又没有标签，我是想可不可在起始密码子之后直接加His，或者在His后直接加终止密码子？
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路在脚下！
5楼2010-08-21 09:53:51
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月月大可

木虫 (著名写手)
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Originally posted by xiuxiu190318 at 2010-08-21 09:53:51:

我是要用全合成的方法合成基因序列，而载体上又没有标签，我是想可不可在起始密码子之后直接加His，或者在His后直接加终止密码子？

解决方法很简单，参照现有商业化的载体就行了。随便Google一些就有。
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6楼2010-08-21 09:57:03
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zhandeguo1

银虫 (小有名气)

his tag

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有很多这方面的载体，很多生物公司或实验室都有。再根据载体的特性选择相应的酶切位点就好。
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7楼2010-08-21 10:16:56
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
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Originally posted by xiuxiu190318 at 2010-08-21 09:03:28:

那可不可以加在C端呢，这个有没有什么判断的依据？我看到有人设计的序列是
ATG GGA TTA TTT CGC  CAT CAT CAC CAT CAC CAT  CGA AAA GGG. . . . . .用的是胰酶切的，胰酶和DK酶切哪一个更 ...

可加C或者N端，都有人用，根据切割方法决定，前提是保证切割后能得到你要的蛋白； 胰酶和EK酶切都可以，但是EK酶专一性更强。
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8楼2010-08-21 11:54:57
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