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speculiar

银虫 (小有名气)

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[交流] 请问谁用过GE的预装柱（镍柱）已有3人参与

GE赠送的1ml用于纯化组氨酸融合蛋白的预装柱。
我用着感觉很不好，不知版内有哪位用过，是否好用，有啥经验可以传授的？
万分感谢，急于毕业，停滞在纯化这一步很久了。万分感谢~~~泪奔~~~~~~~~~

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1楼 2009-10-27 22:31:40

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hhqu

新虫 (初入文坛)

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★
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采用Ni柱对组氨酸标记蛋白质进行分离纯化的过程通常包括装柱、平衡、进料、淋洗、洗脱、再生等步骤。
平衡：用5~10CV的平衡缓冲液平衡层析柱，至流出液电导和pH不变（与平衡液一致）。实际操作中，一般选用中性/弱碱性（pH 7~8）的高盐（0.15~1.0 M NaCl或其它中性盐）缓冲液。其中常用磷酸盐缓冲体系，如20 mM PB+0.5 M NaCl, pH 7.4。对于结合力较强的带组氨酸标记的蛋白质，平衡缓冲液中可加入低浓度（20~40 mM）的咪唑。
进料：样品缓冲液应尽可能与平衡液一致。固体样品可用平衡液溶解配制；低浓度样品溶液可用平衡液透析；高浓度样品溶液可用平衡液稀释。为了避免堵塞层析柱，样品应经离心或微滤处理。进料量根据介质的载量和料液中目标蛋白的含量计算。
为了减少杂蛋白在层析柱上的吸附，可在确保目标蛋白吸附的情况下适当增加样品缓冲液中的咪唑。对于包涵体蛋白，相应地可在平衡、上样和洗脱的缓冲液中加入8M Urea或6M Gua-HCl。
淋洗：上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线。
洗脱：洗脱一般有两种方式，一是采用竞争试剂，如咪唑（0~0.5M）、组氨酸（0~0.05M）、氯化铵（0~2M）等将蛋白质从柱子上置换下来；二是减小pH值，洗脱目标蛋白，大多数蛋白质在pH 4~6的范围内可被洗下来。用竞争试剂咪唑或减小pH值的方法洗脱蛋白质，金属离子仍结合在柱子上；若用竞争试剂组氨酸或氯化铵洗脱蛋白质，会将金属离子和蛋白质的复合物一起洗下来。
洗脱缓冲液中必须加入0.15~1.0 M NaCl以消除离子交换作用。梯度洗脱最好在起始平衡液的恒定pH下进行，可采用线性梯度或阶越式梯度洗脱。