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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请问谁用过GE的预装柱（镍柱）
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speculiar

银虫 (小有名气)

[交流] 请问谁用过GE的预装柱（镍柱） 已有3人参与

GE赠送的1ml用于纯化组氨酸融合蛋白的预装柱。
我用着感觉很不好，不知版内有哪位用过，是否好用，有啥经验可以传授的？
万分感谢，急于毕业，停滞在纯化这一步很久了。万分感谢~~~泪奔~~~~~~~~~
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1楼 2009-10-27 22:31:40
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

hhqu

新虫 (初入文坛)
★
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采用Ni柱对组氨酸标记蛋白质进行分离纯化的过程通常包括装柱、平衡、进料、淋洗、洗脱、再生等步骤。
平衡：用5~10CV的平衡缓冲液平衡层析柱，至流出液电导和pH不变（与平衡液一致）。实际操作中，一般选用中性/弱碱性（pH 7~8）的高盐（0.15~1.0 M NaCl或其它中性盐）缓冲液。其中常用磷酸盐缓冲体系，如20 mM PB+0.5 M NaCl, pH 7.4。对于结合力较强的带组氨酸标记的蛋白质，平衡缓冲液中可加入低浓度（20~40 mM）的咪唑。
进料：样品缓冲液应尽可能与平衡液一致。固体样品可用平衡液溶解配制；低浓度样品溶液可用平衡液透析；高浓度样品溶液可用平衡液稀释。为了避免堵塞层析柱，样品应经离心或微滤处理。进料量根据介质的载量和料液中目标蛋白的含量计算。
为了减少杂蛋白在层析柱上的吸附，可在确保目标蛋白吸附的情况下适当增加样品缓冲液中的咪唑。对于包涵体蛋白，相应地可在平衡、上样和洗脱的缓冲液中加入8M Urea或6M Gua-HCl。
淋洗：上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线。
洗脱：洗脱一般有两种方式，一是采用竞争试剂，如咪唑（0~0.5M）、组氨酸（0~0.05M）、氯化铵（0~2M）等将蛋白质从柱子上置换下来；二是减小pH值，洗脱目标蛋白，大多数蛋白质在pH 4~6的范围内可被洗下来。用竞争试剂咪唑或减小pH值的方法洗脱蛋白质，金属离子仍结合在柱子上；若用竞争试剂组氨酸或氯化铵洗脱蛋白质，会将金属离子和蛋白质的复合物一起洗下来。
洗脱缓冲液中必须加入0.15~1.0 M NaCl以消除离子交换作用。梯度洗脱最好在起始平衡液的恒定pH下进行，可采用线性梯度或阶越式梯度洗脱。
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生物制品 生化分离
4楼2009-10-28 10:00:40
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普通回帖

zibeisha

木虫 (著名写手)
★
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支持，我也马上要做，希望大虾们多多支持交流！！！
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有时我们无奈，有时我们迷茫，可是不管怎样，只要我们积极生活，命运就不会亏待我们。
2楼2009-10-27 22:39:43
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muchong5577

金虫 (正式写手)
★
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告诉你一个buffer
Elution Buffer是：20mM Sodium phosphate，500mM Nacl，500mM Imidazole，pH 7.4
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3楼2009-10-28 01:35:28
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wlt728

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我实验室的用过，不过我没用过
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I am not a hero , but I served with heroes！
5楼2009-10-28 11:14:32
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
对于不同的融合蛋白有不同的效果，所以谁也说不好。纯化这种事儿，很难。
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金币是赌出来的
6楼2009-10-28 11:51:31
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himoo123

铁虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
GE的很好用的啊，要低浓度的咪唑如20mM，50，100洗脱足够体积 可能会纯点
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7楼2009-10-29 16:16:12
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jlc0225

至尊木虫 (著名写手)
★
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我们的镍柱也不好用,估计使用次数多了也不行
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开始新的学习！
8楼2009-10-29 16:23:57
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lansha8331

无虫 (小有名气)
★
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金属镍琼脂糖亲和基质 威格拉斯国产的也不错。进口GE毕竟还是太贵了
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9楼2010-07-21 10:15:02
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辉辉集团

银虫 (正式写手)
应该很好用才对啊
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10楼2010-07-21 11:09:48
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