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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于变性条件下his-tag重组融合蛋白不结合镍柱以及部分结合镍柱情况
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biowandy

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 抛砖引玉 2012-04-17 13:06:45
我自己先提点意见，我们查阅大量资料，国内国外都有，有的认为是个死结。不用去理这个问题 。

但是我想，这是个很奇怪的问题，
第一，对于部分结合的蛋白很不理解，都是变性条件，为啥挂不到，如果是his不暴露，但是为啥有的暴露了？别忘了这是变性条件，没有理由不露出来，而且之前用2-me处理过的，二硫键不是问题。
第二，国外国内有部分认做过实验说不挂但是WB有结果，这说明his还在上面的，这点从部分挂的可以看出来，如果没有his，就不会部分挂了。
第三，我们之前有个蛋白，可溶挂，但是他的包涵体部分挂的不明显。这是很奇怪的事情。
我们认为这个蛋白是有his的，但是不知道什么原因（肯定是自身结构很独特）导致his不完全暴露，那就有一个问题，什么结构能扛得住还原剂和8M尿素。

就当抛砖引玉吧，欢迎大家来拍啊
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2楼2012-04-16 12:55:46
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木虫 (小有名气)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 鼓励发帖交流 2012-04-17 13:07:49
引用回帖:
4楼: Originally posted by biowandy at 2012-04-17 08:34:07:
在变性条件下250mM足够把蛋白洗脱下来，，而且蛋白不可能沉淀在柱子上，因为8M尿素，我之所以判断不挂，是因为流传大量大量的目的蛋白

楼主，变性条件下HIS标签完全暴露，与柱材料结合的更加紧密，所以要用更高的咪唑才能洗脱，非变性的蛋白有时候想要完全洗脱都不止用250的咪唑呀。8M的尿素只不过是让蛋白溶解。不能保证洗脱。未结合上不知楼主是用AKTA过的还是泵还是其他什么方式过的，可否让柱材料与蛋白先孵育一段时间，再流出。楼主可以做个试验，洗脱完后取10微升柱材料加入考马斯亮蓝看变色不，要是变色就说明蛋白未完全洗脱。如果未完全洗脱，可以用1M的咪唑试试。希望可以帮到你。
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5楼2012-04-17 09:50:35
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