| 查看: 4392 | 回复: 17 | ||||
| 本帖产生 2 个 BioEPI ，点击这里进行查看 | ||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||||
[交流]
关于变性条件下his-tag重组融合蛋白不结合镍柱以及部分结合镍柱情况
|
||||
|
最近做包涵体比较多，总体还好，但是遇到二个很棘手的问题： 1：有些蛋白就算加了2-ME，在8M尿素中一点都不结合镍柱 2：有些蛋白部分挂镍柱，FT总是很多。 请各位在交流之前先看好下面的条件： 1，我们一次处理12个蛋白，有的是ok的，有的不挂，或者部分挂，因此排除什么pH，buffer，离子强度的问题，因为如果是这个问题，那就是都不挂，或者都部分挂。 当然大家不用说是蛋白需要不同buffer，如果你要 说这个因素，那我请问你，你每次做镍柱亲和会用不同buffer吗，有区别吗？ 何况不管invotrogen还是novagen的标准protocol也是一个buffer，没搞得花里胡哨的。这个版里面提这个问题的很多，很多都是更换过buffer，绝对是无效的，我们自己也做过这方面的试验，没结果，因此buffer不是问题，我们是变性纯化。 2，我们具体就是在洗涤包涵体后，用8M尿素溶解，同时加入10mM 2-me，在这里强调下，包涵体洗涤不是大问题，溶解不是大问题，我们基本都能溶解出来，电泳分析的结果。 3，我们binding buffer没有加任何咪唑，没有edta，刚开始加入的b-me在上柱子前我们处理了，不会对镍柱用影像，同时his-tag在N端，因此排除提前终止的可能。 4，我们实验室纯化了快1000个蛋白了，因此低级的错误在我们这里是不会的。我们每次试验时重复的，因此不用怀疑我们手法问题，要不然不会做这么多。 科研有不确定因素，但是不是毫无规律可循，因此请大家结合自身经验来讨论这个问题，而不是东一锄头，西一板斧的瞎提。请看清楚我们做过的努力再交流。谢谢！ [ Last edited by biowandy on 2012-4-16 at 12:48 ] |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 重组蛋白纯化 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
翌日到» 猜你喜欢
一志愿华东师范生物学326分，求调剂
已经有4人回复
-
071000生物学调剂求助
已经有11人回复
-
化学工程与技术324调剂
已经有16人回复
-
298求调剂
已经有4人回复
-
282，求调剂
已经有9人回复
-
考研调剂
已经有19人回复
-
308求调剂
已经有20人回复
-
中科院总分315求调剂
已经有3人回复
-
求调剂 材料与工程 324分 专硕
已经有3人回复
-
一志愿矿大，材料工程专硕314分，0856可调都可以
已经有12人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 镍柱纯化His标签蛋白，洗脱不下来
已经有11人回复
- 镍柱亲和层析纯化
已经有6人回复
- 亲和镍柱那个公司的好？
已经有6人回复
- 蛋白过镍柱纯化，在用咪唑洗脱后需要做透析，透析怎么做？？？
已经有15人回复
- 空气中氧化能增加由二硫键形成的二聚体蛋白质的量吗
已经有3人回复
- 请问His-tag（组氨酸标签）怎么加到酶蛋白上？
已经有20人回复
- 蛋白前面有一个his-tag和sumo-tag,想去掉sumo-tag，只留下一个his-tag，该怎么做
已经有5人回复
- 求推荐用于his-tag纯化蛋白的镍柱~
已经有14人回复
- GST 和 His Tag的选择
已经有7人回复
- 带HIS-tag标签蛋白过NI-NDA挂不上柱子
已经有5人回复
- 请问His-tag（组氨酸标签）怎么加到我的蛋白上去？
已经有13人回复
- His Tag融合蛋白纯化
已经有8人回复
- 20%乙醇会让蛋白变性失活不？
已经有3人回复
- 关于镍柱纯化蛋白
已经有10人回复
- 关于带his-tag的膜蛋白镍柱纯化
已经有10人回复
- his标签蛋白纯化，不挂柱
已经有18人回复
- 【求助/交流】关于his-tagged 蛋白纯化
已经有9人回复
- 【求助/交流】为什么镍柱纯化可溶性蛋白，电泳结果总是显示不纯呢？
已经有9人回复
- 【求助】为什么酸变性淀粉在我用碱中和的时候，稍微浓度高一点，就会有粘粘的出现？
已经有7人回复
- 基因带六个his标签，蛋白纯化时为何挂不上镍柱
已经有26人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
招收硕士研究生
+5/466
-
2026年“海洋生物”硕士研究生调剂需求信息—— 河北科技师范学院，海洋科学研究中心
+1/190
-
延安大学接收化学与化工学院接收调剂生（化学、化工学硕和材料与化工专硕）
+2/52
-
2026 硕士研究生调剂｜河南工业大学化学化工学院名额开放
+2/48
-
【考研调剂】华侨大学发光材料与信息显示研究院接收专硕和学硕调剂
+1/41
-
上海应用技术大学招收化学、物理、材料类调剂生
+1/40
-
河南工业大学化学化工学院 2026 年硕士调剂正在进行！
+1/38
-
中国石油大学（北京）理学院2026年硕士研究生接收调剂生：物理、化学、材料等
+1/37
-
湖南理工大学调剂系统已开。 化学、化工、材料化工 调剂指标充足，录取率高，欢迎调剂
+1/11
-
欢迎调剂攀枝花学院化学工程专业，资源与环境专业，线上复试
+1/5
-
河南师范大学与中国水产科学院联合培养 招收水产养殖方向调剂硕士生1名
+1/5
-
济南大学2026年硕士研究生招生预调剂公告
+1/4
-
海水鱼类遗传育种课题组招收硕士调剂生
+1/4
-
招收化学/材料调剂同学
+1/4
-
北京高校副校长团队招收机械类，环境类学硕和专硕
+1/4
-
河南理工大学化学化工学院招收材料、化工类专业调剂研究生
+1/4
-
齐齐哈尔大学李莉课题组诚招2026级考研调剂生（学硕和专硕）
+1/3
-
招计算机调剂
+1/2
-
线上复试：河南理工大学 化工学院 接收调剂硕士研究生
+1/2
-
南通大学-交通与土木工程学院 招调剂学生
+1/1
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 鼓励发帖交流 2012-04-17 13:07:49
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 鼓励发帖交流 2012-04-17 13:07:49
|
楼主，变性条件下HIS标签完全暴露，与柱材料结合的更加紧密，所以要用更高的咪唑才能洗脱，非变性的蛋白有时候想要完全洗脱都不止用250的咪唑呀。8M的尿素只不过是让蛋白溶解。不能保证洗脱。未结合上不知楼主是用AKTA过的还是泵还是其他什么方式过的，可否让柱材料与蛋白先孵育一段时间，再流出。楼主可以做个试验，洗脱完后取10微升柱材料加入考马斯亮蓝看变色不，要是变色就说明蛋白未完全洗脱。如果未完全洗脱，可以用1M的咪唑试试。希望可以帮到你。 |
5楼2012-04-17 09:50:35
★ ★ ★ ★ ★
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 抛砖引玉 2012-04-17 13:06:45
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 抛砖引玉 2012-04-17 13:06:45
|
我自己先提点意见，我们查阅大量资料，国内国外都有，有的认为是个死结。不用去理这个问题 。 但是我想，这是个很奇怪的问题， 第一，对于部分结合的蛋白很不理解，都是变性条件，为啥挂不到，如果是his不暴露，但是为啥有的暴露了？别忘了这是变性条件，没有理由不露出来，而且之前用2-me处理过的，二硫键不是问题。 第二，国外国内有部分认做过实验说不挂但是WB有结果，这说明his还在上面的，这点从部分挂的可以看出来，如果没有his，就不会部分挂了。 第三，我们之前有个蛋白，可溶挂，但是他的包涵体部分挂的不明显。这是很奇怪的事情。 我们认为这个蛋白是有his的，但是不知道什么原因（肯定是自身结构很独特）导致his不完全暴露，那就有一个问题，什么结构能扛得住还原剂和8M尿素。 就当抛砖引玉吧，欢迎大家来拍啊 |
2楼2012-04-16 12:55:46
3楼2012-04-16 16:18:17
4楼2012-04-17 08:34:07
