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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于变性条件下his-tag重组融合蛋白不结合镍柱以及部分结合镍柱情况
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biowandy

木虫 (正式写手)

[交流] 关于变性条件下his-tag重组融合蛋白不结合镍柱以及部分结合镍柱情况

最近做包涵体比较多，总体还好，但是遇到二个很棘手的问题：
1：有些蛋白就算加了2-ME，在8M尿素中一点都不结合镍柱
2：有些蛋白部分挂镍柱，FT总是很多。

请各位在交流之前先看好下面的条件：
1，我们一次处理12个蛋白，有的是ok的，有的不挂，或者部分挂，因此排除什么pH，buffer，离子强度的问题，因为如果是这个问题，那就是都不挂，或者都部分挂。 当然大家不用说是蛋白需要不同buffer，如果你要 说这个因素，那我请问你，你每次做镍柱亲和会用不同buffer吗，有区别吗？ 何况不管invotrogen还是novagen的标准protocol也是一个buffer，没搞得花里胡哨的。这个版里面提这个问题的很多，很多都是更换过buffer，绝对是无效的，我们自己也做过这方面的试验，没结果，因此buffer不是问题，我们是变性纯化。

2，我们具体就是在洗涤包涵体后，用8M尿素溶解，同时加入10mM 2-me，在这里强调下，包涵体洗涤不是大问题，溶解不是大问题，我们基本都能溶解出来，电泳分析的结果。

3，我们binding buffer没有加任何咪唑，没有edta，刚开始加入的b-me在上柱子前我们处理了，不会对镍柱用影像，同时his-tag在N端，因此排除提前终止的可能。

4，我们实验室纯化了快1000个蛋白了，因此低级的错误在我们这里是不会的。我们每次试验时重复的，因此不用怀疑我们手法问题，要不然不会做这么多。

科研有不确定因素，但是不是毫无规律可循，因此请大家结合自身经验来讨论这个问题，而不是东一锄头，西一板斧的瞎提。请看清楚我们做过的努力再交流。谢谢！

[ Last edited by biowandy on 2012-4-16 at 12:48 ]
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1楼 2012-04-16 12:39:49
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天际雾影

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
送红花一朵
楼主，不知道你现在还做纯化么。我有一个蛋白在包涵体里，不管用啥变性剂溶解后都能结合到NI柱上，但最后用500mM咪唑、降低PH到5.0甚至用100mMEDTA都不能把蛋白洗下来。每一步都用SDS-PAGE检测过。后来用透析复性，结果在1Murea透析到PBS中时出现了大量沉淀。不知道你有啥见解？
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17楼2016-11-21 21:53:34
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