| 查看: 5058 | 回复: 17 | ||||
| 本帖产生 2 个 BioEPI ，点击这里进行查看 | ||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||||
[交流]
关于变性条件下his-tag重组融合蛋白不结合镍柱以及部分结合镍柱情况
|
||||
|
最近做包涵体比较多，总体还好，但是遇到二个很棘手的问题： 1：有些蛋白就算加了2-ME，在8M尿素中一点都不结合镍柱 2：有些蛋白部分挂镍柱，FT总是很多。 请各位在交流之前先看好下面的条件： 1，我们一次处理12个蛋白，有的是ok的，有的不挂，或者部分挂，因此排除什么pH，buffer，离子强度的问题，因为如果是这个问题，那就是都不挂，或者都部分挂。 当然大家不用说是蛋白需要不同buffer，如果你要 说这个因素，那我请问你，你每次做镍柱亲和会用不同buffer吗，有区别吗？ 何况不管invotrogen还是novagen的标准protocol也是一个buffer，没搞得花里胡哨的。这个版里面提这个问题的很多，很多都是更换过buffer，绝对是无效的，我们自己也做过这方面的试验，没结果，因此buffer不是问题，我们是变性纯化。 2，我们具体就是在洗涤包涵体后，用8M尿素溶解，同时加入10mM 2-me，在这里强调下，包涵体洗涤不是大问题，溶解不是大问题，我们基本都能溶解出来，电泳分析的结果。 3，我们binding buffer没有加任何咪唑，没有edta，刚开始加入的b-me在上柱子前我们处理了，不会对镍柱用影像，同时his-tag在N端，因此排除提前终止的可能。 4，我们实验室纯化了快1000个蛋白了，因此低级的错误在我们这里是不会的。我们每次试验时重复的，因此不用怀疑我们手法问题，要不然不会做这么多。 科研有不确定因素，但是不是毫无规律可循，因此请大家结合自身经验来讨论这个问题，而不是东一锄头，西一板斧的瞎提。请看清楚我们做过的努力再交流。谢谢！ [ Last edited by biowandy on 2012-4-16 at 12:48 ] |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 重组蛋白纯化 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
翌日到» 猜你喜欢
哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？
已经有9人回复
-
欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律
已经有72人回复
-
咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否
已经有26人回复
-
我的国基提前知道中了，可是同事的操作让我实在接受不了，怎么会有这样的人
已经有16人回复
-
有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验）
已经有12人回复
-
招聘 金属平磨液，抛光液研发工程师
已经有3人回复
-
时间戳又变了8-15
已经有23人回复
-
filecode=后面第一个是大写字母
已经有7人回复
-
filecode
已经有12人回复
-
小木虫上这么多卖论文的，真有人买论文么？感觉没必要啊
已经有13人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 镍柱纯化His标签蛋白，洗脱不下来
已经有11人回复
- 镍柱亲和层析纯化
已经有6人回复
- 亲和镍柱那个公司的好？
已经有6人回复
- 蛋白过镍柱纯化，在用咪唑洗脱后需要做透析，透析怎么做？？？
已经有15人回复
- 空气中氧化能增加由二硫键形成的二聚体蛋白质的量吗
已经有3人回复
- 请问His-tag（组氨酸标签）怎么加到酶蛋白上？
已经有20人回复
- 蛋白前面有一个his-tag和sumo-tag,想去掉sumo-tag，只留下一个his-tag，该怎么做
已经有5人回复
- 求推荐用于his-tag纯化蛋白的镍柱~
已经有14人回复
- GST 和 His Tag的选择
已经有7人回复
- 带HIS-tag标签蛋白过NI-NDA挂不上柱子
已经有5人回复
- 请问His-tag（组氨酸标签）怎么加到我的蛋白上去？
已经有13人回复
- His Tag融合蛋白纯化
已经有8人回复
- 20%乙醇会让蛋白变性失活不？
已经有3人回复
- 关于镍柱纯化蛋白
已经有10人回复
- 关于带his-tag的膜蛋白镍柱纯化
已经有10人回复
- his标签蛋白纯化，不挂柱
已经有18人回复
- 【求助/交流】关于his-tagged 蛋白纯化
已经有9人回复
- 【求助/交流】为什么镍柱纯化可溶性蛋白，电泳结果总是显示不纯呢？
已经有9人回复
- 【求助】为什么酸变性淀粉在我用碱中和的时候，稍微浓度高一点，就会有粘粘的出现？
已经有7人回复
- 基因带六个his标签，蛋白纯化时为何挂不上镍柱
已经有26人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
今天看到省基金挂了，希望国基面上能中吧
+5/425
-
祝福！基金中中中！！！！
+1/397
-
期待你的到来
+1/375
-
北京信息科技大学机电工程学院硕士研究生招生线上宣讲会-8月16日
+5/255
-
上海同城
+1/118
-
中国科学院空天院精密干涉测量团队 精密机械结构工程师招聘启事
+1/83
-
中国科学院空天院精密干涉测量团队 精密机械结构工程师招聘启事
+1/82
-
中国科学院空天院精密干涉测量团队招聘光学/算法/机械方向博士后/特别研究助理/工程师
+1/79
-
祝福！祈福！！基金中中中！
+5/55
-
加拿大/英属哥伦比亚大学曹彦凯课题组招收博后 [机器人/控制方向]
+1/36
-
祈福
+1/18
-
希望这篇论文能中
+2/12
-
华南理工，博士后
+1/11
-
北京理工大学-集成电路与电子学院杰青团队-招博士后
+1/8
-
北理工集成电路杰青团队 | 诚招科助理
+1/7
-
西安交通大学杜宝吉课题组招收申请考核制博士生
+2/6
-
27推免-广州医科大学封红亮教授招收精神医学应用心理学推免生
+1/5
-
海南大学化学院—功能分子器件团队2027博士招生+博士后招聘
+1/2
-
中山大学国家级青年人才课题组招收推免硕士2名（2027年入学）
+2/2
-
KFUPM Turki Baroud组招全奖博士/博后｜下一代膜材料・水凝胶・清洁水
+1/1
12楼2012-05-24 12:48:25
★ ★ ★ ★ ★
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 抛砖引玉 2012-04-17 13:06:45
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 抛砖引玉 2012-04-17 13:06:45
|
我自己先提点意见，我们查阅大量资料，国内国外都有，有的认为是个死结。不用去理这个问题 。 但是我想，这是个很奇怪的问题， 第一，对于部分结合的蛋白很不理解，都是变性条件，为啥挂不到，如果是his不暴露，但是为啥有的暴露了？别忘了这是变性条件，没有理由不露出来，而且之前用2-me处理过的，二硫键不是问题。 第二，国外国内有部分认做过实验说不挂但是WB有结果，这说明his还在上面的，这点从部分挂的可以看出来，如果没有his，就不会部分挂了。 第三，我们之前有个蛋白，可溶挂，但是他的包涵体部分挂的不明显。这是很奇怪的事情。 我们认为这个蛋白是有his的，但是不知道什么原因（肯定是自身结构很独特）导致his不完全暴露，那就有一个问题，什么结构能扛得住还原剂和8M尿素。 就当抛砖引玉吧，欢迎大家来拍啊 |
2楼2012-04-16 12:55:46
3楼2012-04-16 16:18:17
4楼2012-04-17 08:34:07
