| 查看: 4283 | 回复: 17 | ||||
| 本帖产生 2 个 BioEPI ，点击这里进行查看 | ||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||||
[交流]
关于变性条件下his-tag重组融合蛋白不结合镍柱以及部分结合镍柱情况
|
||||
|
最近做包涵体比较多，总体还好，但是遇到二个很棘手的问题： 1：有些蛋白就算加了2-ME，在8M尿素中一点都不结合镍柱 2：有些蛋白部分挂镍柱，FT总是很多。 请各位在交流之前先看好下面的条件： 1，我们一次处理12个蛋白，有的是ok的，有的不挂，或者部分挂，因此排除什么pH，buffer，离子强度的问题，因为如果是这个问题，那就是都不挂，或者都部分挂。 当然大家不用说是蛋白需要不同buffer，如果你要 说这个因素，那我请问你，你每次做镍柱亲和会用不同buffer吗，有区别吗？ 何况不管invotrogen还是novagen的标准protocol也是一个buffer，没搞得花里胡哨的。这个版里面提这个问题的很多，很多都是更换过buffer，绝对是无效的，我们自己也做过这方面的试验，没结果，因此buffer不是问题，我们是变性纯化。 2，我们具体就是在洗涤包涵体后，用8M尿素溶解，同时加入10mM 2-me，在这里强调下，包涵体洗涤不是大问题，溶解不是大问题，我们基本都能溶解出来，电泳分析的结果。 3，我们binding buffer没有加任何咪唑，没有edta，刚开始加入的b-me在上柱子前我们处理了，不会对镍柱用影像，同时his-tag在N端，因此排除提前终止的可能。 4，我们实验室纯化了快1000个蛋白了，因此低级的错误在我们这里是不会的。我们每次试验时重复的，因此不用怀疑我们手法问题，要不然不会做这么多。 科研有不确定因素，但是不是毫无规律可循，因此请大家结合自身经验来讨论这个问题，而不是东一锄头，西一板斧的瞎提。请看清楚我们做过的努力再交流。谢谢！ [ Last edited by biowandy on 2012-4-16 at 12:48 ] |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 重组蛋白纯化 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
翌日到» 猜你喜欢
求调剂
已经有3人回复
-
化工270求调剂
已经有7人回复
-
276求调剂
已经有5人回复
-
295求调剂
已经有8人回复
-
材料学硕318求调剂
已经有16人回复
-
268求调剂
已经有4人回复
-
此成果不能导入原因：元数据必填信息不完整，可 进行补充。
已经有5人回复
-
材料工程专硕283求调剂
已经有6人回复
-
281求调剂
已经有8人回复
-
求调剂
已经有9人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 镍柱纯化His标签蛋白，洗脱不下来
已经有11人回复
- 镍柱亲和层析纯化
已经有6人回复
- 亲和镍柱那个公司的好？
已经有6人回复
- 蛋白过镍柱纯化，在用咪唑洗脱后需要做透析，透析怎么做？？？
已经有15人回复
- 空气中氧化能增加由二硫键形成的二聚体蛋白质的量吗
已经有3人回复
- 请问His-tag（组氨酸标签）怎么加到酶蛋白上？
已经有20人回复
- 蛋白前面有一个his-tag和sumo-tag,想去掉sumo-tag，只留下一个his-tag，该怎么做
已经有5人回复
- 求推荐用于his-tag纯化蛋白的镍柱~
已经有14人回复
- GST 和 His Tag的选择
已经有7人回复
- 带HIS-tag标签蛋白过NI-NDA挂不上柱子
已经有5人回复
- 请问His-tag（组氨酸标签）怎么加到我的蛋白上去？
已经有13人回复
- His Tag融合蛋白纯化
已经有8人回复
- 20%乙醇会让蛋白变性失活不？
已经有3人回复
- 关于镍柱纯化蛋白
已经有10人回复
- 关于带his-tag的膜蛋白镍柱纯化
已经有10人回复
- his标签蛋白纯化，不挂柱
已经有18人回复
- 【求助/交流】关于his-tagged 蛋白纯化
已经有9人回复
- 【求助/交流】为什么镍柱纯化可溶性蛋白，电泳结果总是显示不纯呢？
已经有9人回复
- 【求助】为什么酸变性淀粉在我用碱中和的时候，稍微浓度高一点，就会有粘粘的出现？
已经有7人回复
- 基因带六个his标签，蛋白纯化时为何挂不上镍柱
已经有26人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
寻找那个能让“稳定生活”变得“更有趣”的你
+1/154
-
2026年药物化学博士招生
+1/83
-
【最后机会】深圳大学2026级土木工程博士急招
+5/65
-
艾里卡特 (Alicat) 本安ia防爆型质量流量控制器应用于电解制氢
+2/62
-
齐鲁工业大学轻工学部博导课题组招收两名硕士调剂生
+1/37
-
华中科技大学材料学院国家级人才团队招收2026年硕士研究生
+1/35
-
湖南大学材料院陶益杰老师招收2026年秋季入学博士生一名-超材料方向
+1/33
-
澳门理工大学人工智能智慧康养方向26 年9月入学博士招生有奖学金
+1/32
-
哈工大 化工学院招26级博士生（钙钛矿太阳能电池/传感器方向）
+1/31
-
江西师范大学王昆-卢章辉课题组招化学方向研究生两名
+1/27
-
look 26届 || 计算机、电子信息类、电科、控制、通信考研T j信息醇：1o33 7747 o3
+1/17
-
【青岛大学】2026年生物与医药申请考核制博士生招生（含少数民族骨干人才）
+1/12
-
陕西科技大学2026年博士研究生招生
+1/10
-
考研调剂交流
+1/8
-
26届计算机、电子信息类、电科、控制、通信考研T j信息醇：10+33+77+47+03
+1/7
-
食品考研交流
+1/4
-
内蒙古大学青年长江学者王蕾教授团队2026年硕士调剂公告。
+1/4
-
中科院深圳先进技术研究院成会明院士/唐永炳杰青团队拟招聘博士后若干名。
+1/2
-
武汉纺织大学2026年招收硕士研究生【高性能、功能纺织复合材料方向】
+1/2
-
武汉科技大学黄思煜教授招收博/硕士及师资博士后、特任教授
+1/1
16楼2014-07-09 11:09:44
★ ★ ★ ★ ★
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 抛砖引玉 2012-04-17 13:06:45
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 抛砖引玉 2012-04-17 13:06:45
|
我自己先提点意见，我们查阅大量资料，国内国外都有，有的认为是个死结。不用去理这个问题 。 但是我想，这是个很奇怪的问题， 第一，对于部分结合的蛋白很不理解，都是变性条件，为啥挂不到，如果是his不暴露，但是为啥有的暴露了？别忘了这是变性条件，没有理由不露出来，而且之前用2-me处理过的，二硫键不是问题。 第二，国外国内有部分认做过实验说不挂但是WB有结果，这说明his还在上面的，这点从部分挂的可以看出来，如果没有his，就不会部分挂了。 第三，我们之前有个蛋白，可溶挂，但是他的包涵体部分挂的不明显。这是很奇怪的事情。 我们认为这个蛋白是有his的，但是不知道什么原因（肯定是自身结构很独特）导致his不完全暴露，那就有一个问题，什么结构能扛得住还原剂和8M尿素。 就当抛砖引玉吧，欢迎大家来拍啊 |
2楼2012-04-16 12:55:46
3楼2012-04-16 16:18:17
4楼2012-04-17 08:34:07
