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[交流]
包涵体有活性吗？
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各位大侠们，我现在实验中遇到一个奇怪的问题：构建了一个重组菌，全细胞活性很高，但在细胞破碎时，不管怎么破都破不开，目标蛋白在沉淀中一坨，上清很少。怀疑过是包涵体，但是沉淀中活性居然很高。 为了确定是不是包涵体，我这几天在诱导表达时，做了一个不加IPTG诱导的对照，发现不进行诱导的很容易就破开了，破后的溶液是半透明的，同时诱导后的还是白乎乎的，跑蛋白电泳结果一样。所以应该是包涵体吧。 不知各位高人能否给些建议。谢谢啦！都纠结了两周了，还是不知道怎么办？ |
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
hraikeyan: 金币+3 2013-05-20 08:48:30
kx444555: 金币+10, 解释的很清楚,这样的虫子很热心 2013-05-20 09:38:45
hraikeyan: 金币+2 2013-05-27 22:19:33
gyesang: 回帖置顶 2013-05-29 19:14:21
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hraikeyan: 金币+2 2013-05-27 22:19:33
gyesang: 回帖置顶 2013-05-29 19:14:21
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楼主，你好！我有以下几点供你采纳！ 1,. 包涵体是主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。主要原因有：1）表达量过高，2）含有较高成分的含硫氨基酸，3）发酵过程中pH的影响，由于与等电点相近，较容易形成包涵体，4）重组蛋白为异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。确定是不是包涵体，你可以从这几点入手！ 2. 包涵体有活性的很少见！你可以将包涵体用你的破碎buffer多洗两遍，分别检测洗液和包涵体有没有活性！如果没有活性了，那可能就是包涵体了；如果有活性，那可能就是你的破碎buffer不合适了！我猜可能有以下问题“ 在这之前，你先将你的protein用DNAman分析一下，蛋白的性质！！！！非常重要！！！！ 1）.你的lysis buffer pH不合适，我猜可能你的蛋白pI在其附近，所以破碎之后，容易形成沉淀！但并不影响其活性！！ 2）.如果你的lysis buffer 其中不含有盐或者盐浓度很低，我猜可能你的Recombinant protein 是盐溶性蛋白！建议适当的添加盐浓度，有利于提高蛋白的溶解性！ 3）假如你的蛋白之中含有二硫键的存在，通过添加一定浓度的DTT或者beta-巯基乙醇！高的可以选择50~100mM,低的可以选择5mM！如果你需要过Ni柱纯化，可以选择1~2mM，一般的NI柱还是能承受的！还原剂可以起到一定的增溶的作用！ 4）破碎条件的优化，破碎的过程中尽量避免蛋白液体发热！！！温度的变化会使蛋白沉淀！一般选用冰水混合物冰浴破碎！并每隔5min查看一次！ 好吧，就这么多吧！希望能给你点提醒！ |
3楼2013-05-17 22:04:31
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4楼2013-05-18 08:34:12