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ss000qq

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[求助] T7载体的IPTG诱导

大家好！
   我在做基因克隆，载体用的是T7载体，由于克隆的基因较多，所以蛋白诱导方面比较麻烦。可能每个基因所表达蛋白的条件都不一样，我现在想粗略的看一下诱导时间和温度以及诱导剂添加量对诱导的影响，我用的诱导剂是IPTG。我想请教一下一般IPTG在温度，时间，用量上有没有通用的范围或规则？我有看过文献报道，说T7载体用IPTG诱导会容易形成包涵体。
   而且我现在是粗略的诱导检测有无蛋白表达，所以并没有在OD=0.6-0.8时诱导，而且诱导一般是过夜诱的，诱导温度20℃，不知会否对这种载体的诱导有影响？
   我的宿主细胞是BL21. 请同行高手给与指教！

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1楼 2012-02-23 18:52:50

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qjy_134

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amisking(金币+2): 鼓励积极应助！ 2012-02-23 20:46:42
ss000qq(金币+1): ★有帮助谢谢 2012-02-25 13:59:57

你用1ml TB 培养基（用那种透气好一点的试管），挑2-3个菌落，37@250rpm培养个2-3个小时（菌看上去浑浊了），加IPTG终浓度1mM.再培养个2个小时，电泳看结果

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2楼2012-02-23 20:33:17

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楼: Originally posted by qjy_134 at 2012-02-23 20:33:17:
你用1ml TB 培养基（用那种透气好一点的试管），挑2-3个菌落，37@250rpm培养个2-3个小时（菌看上去浑浊了），加IPTG终浓度1mM.再培养个2个小时，电泳看结果

你的诱导温度不调吗？还是高温诱导？

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3楼2012-02-23 21:16:44

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lxj341401

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【答案】应助回帖

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如果只是看能不能表达，不涉及的到表达出来的有没有活性的问题，1mMIPTG，37度2个小时就可以检测的。

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4楼2012-02-23 21:30:27

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楼: Originally posted by lxj341401 at 2012-02-23 21:30:27:
如果只是看能不能表达，不涉及的到表达出来的有没有活性的问题，1mMIPTG，37度2个小时就可以检测的。

哦，谢谢哈

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5楼2012-02-24 09:35:38

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zhiqiang5070

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小丹木木(金币+2): 鼓励应助 2012-02-24 10:49:26

貌似T7启动子IPTG用0.4mM就能诱导出来，T7lac才需要1mM。温度一般只会影响它的可溶性吧和产速。OD600在0.4-1都行的。至于包涵体跟你的片段长度和你选择的载体有关，融合表达和带有信号肽的载体容易可溶表达

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无善无恶心之体

6楼2012-02-24 09:43:40

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楼: Originally posted by zhiqiang5070 at 2012-02-24 09:43:40:
貌似T7启动子IPTG用0.4mM就能诱导出来，T7lac才需要1mM。温度一般只会影响它的可溶性吧和产速。OD600在0.4-1都行的。至于包涵体跟你的片段长度和你选择的载体有关，融合表达和带有信号肽的载体容易可溶表达

谢谢，能麻烦你把包涵体形成的条件及原理解释一下吗？我不是很懂。

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7楼2012-02-24 13:35:20

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weilson

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(1)表达量过高，合成速度太快，没有足够时间折叠

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8楼2012-02-24 21:57:34

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weilson

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ss000qq(金币+2): ★★★很有帮助谢谢 2012-02-25 13:58:20

（2）异源表达，真核糖蛋白无法糖基化使中间体溶解度下降；（3）重组蛋白中硫氨酸含量多，导致包涵体形成（4）重组蛋白分泌序列存在阻碍折叠

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9楼2012-02-24 22:01:48

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wulei0708

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T7启动子的载体在BL21中是不可能表达的，必须在BL21(DE3)中才能表达。

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10楼2012-06-28 09:21:00

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