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feiye2214

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】十万火急，IPTG诱导是怎么回事，给我说个大概 已有5人参与

RT：IPTG诱导大致原理
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1楼 2010-10-22 14:08:05
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silicare

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2楼2010-10-22 14:29:00
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★
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看懂了乳糖操纵子就知道IPTG诱导的原理了
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3楼2010-10-22 14:56:45
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feiye2214

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2010-10-22 14:56:45:
看懂了乳糖操纵子就知道IPTG诱导的原理了

如果我的目的基因的载体没有乳糖操纵子，就不能表达了吗？
还是有其他的诱导方式？pGEX-4T-1装载一个目的基因
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4楼2010-10-22 17:10:58
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临风7071

木虫 (正式写手)
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dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-10-23 12:01:29
引用回帖:
Originally posted by feiye2214 at 2010-10-22 17:10:58:

如果我的目的基因的载体没有乳糖操纵子，就不能表达了吗？
还是有其他的诱导方式？pGEX-4T-1装载一个目的基因

可以的，pGEX-4T-1的载体上有T7 启动子，当转导大肠杆菌中一定要是DE3的，就可以表达的。DE3的大肠杆菌的基因组中整合了T7 RNA聚合酶基因，可以高效表达。如果连到PET载体上，那就需要IPTG诱导了
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5楼2010-10-22 19:33:54
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feiye2214

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
amisking(金币+3):good！ 2010-10-22 20:25:40
引用回帖:
Originally posted by 临风7071 at 2010-10-22 19:33:54:

可以的，pGEX-4T-1的载体上有T7 启动子，当转导大肠杆菌中一定要是DE3的，就可以表达的。DE3的大肠杆菌的基因组中整合了T7 RNA聚合酶基因，可以高效表达。如果连到PET载体上，那就需要IPTG诱导了

遇到高手了，我就把我做的跟你说说，帮我看看哈！

我将EGFP基因（来自pEGFP-1，酶切位点是Not I/EcoR I）插到上图的pGEX-4T-1的Not I/EcoR I中！这样重组的质粒应该能表达EGFP 吧，要在DE3大肠杆菌中表达？不是很清楚，我是直接转到DH5a感受态中的，要换菌还是怎么诱导？才能让EGFP在大肠杆菌中表达哈！
这是我的pEGFP-1图



[ Last edited by feiye2214 on 2010-10-22 at 20:15 ]
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6楼2010-10-22 20:13:51
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临风7071

木虫 (正式写手)
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dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-10-23 12:01:44
引用回帖:
Originally posted by feiye2214 at 2010-10-22 20:13:51:

遇到高手了，我就把我做的跟你说说，帮我看看哈！

我将EGFP基因（来自pEGFP-1，酶切位点是Not I/EcoR I）插到上图的pGEX-4T-1的Not I/EcoR I中 ...

你的载体是tac启动子，就是trp启动子和lac启动子合成的新的启动子，所以需要iptg的诱导，所以转化到大肠杆菌BL21中，要是BL21也可以是BL21(DE3)，因为BL21是有蛋白酶缺陷的菌株，不会降解目的蛋白。一般我们表达就用BL21(DE3）就行了
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7楼2010-10-23 10:07:43
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feiye2214

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 临风7071 at 2010-10-23 10:07:43:

你的载体是tac启动子，就是trp启动子和lac启动子合成的新的启动子，所以需要iptg的诱导，所以转化到大肠杆菌BL21中，要是BL21也可以是BL21(DE3)，因为BL21是有蛋白酶缺陷的菌株，不会降解目的蛋白。一般我们表达 ...

还是搞不清楚，BL21和BL21（DE3）不是一样的？BL21是有蛋白酶缺陷的菌株，不会降解目的蛋白；BL21（DE3）呢？
BL21是有蛋白酶缺陷的菌株，不会降解目的蛋白，那么无需诱导直接表达？
我的启动子是tac启动子所以需要iptg的诱导，那还是要诱导啊？
糊涂了，有点乱
大侠啊，告诉我怎么做啊
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8楼2010-10-23 21:34:46
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临风7071

木虫 (正式写手)
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引用回帖:
Originally posted by feiye2214 at 2010-10-23 21:34:46:

还是搞不清楚，BL21和BL21（DE3）不是一样的？BL21是有蛋白酶缺陷的菌株，不会降解目的蛋白；BL21（DE3）呢？
BL21是有蛋白酶缺陷的菌株，不会降解目的蛋白，那么无需诱导直接表达？
我的启动子是tac启动子所 ...

BL21（DE3）是在BL21菌株的基础上，吧T7RNA聚合酶基因整合在细菌基因组中，DE3代表的是溶源性。BL21是有蛋白酶缺陷的菌株，不会降解目的蛋白，但是肯定要IPTG诱导高效表达。tac启动子含有Lac启动子，所以可以受IPTG高效诱导。
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9楼2010-10-24 09:38:28
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木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
表达载体上的Tac启动子是杂合trp启动子和lac启动子得来,转录起始位点与RBS之间有操纵基因lacO,阻遏蛋白lacI在没有诱导剂时会结合到lacO,有诱导剂时,阻遏蛋白就结合不了,启动子就可以转录lacO后面的基因.通常质粒拷贝数高,lacO的数量多,宿主本身的lacI不足以阻遏.一般为了降低本底表达,提高质粒稳定性,会在增加表达载体上插入阻遏蛋白lacI基因。由于质粒带有lacI，lacO，可以在各种大肠杆菌进行表达。
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为什么
10楼2013-05-28 09:16:08
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