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蛋白之家

新虫 (小有名气)

[交流] pET28a载体和目的基因

现在想将目的基因连到载体上，转入大肠杆菌中，然后测目的基因所代表的酶的活性。但是pET28a作为载体，有人说如果目的基因连到这个载体上，测酶活的话，酶是没有活性的。
不清楚这里面的原因，到底是为什么？
难道说目的基因连到载体上在大肠杆菌中不表达？还是什么原因
请大家帮忙  谢谢
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1楼 2012-09-07 18:35:47
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回帖置顶 ( 共有7个 )

馋猫

银虫 (小有名气)
★
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
你说的太笼统
有没有活性只有测了之后才知道
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3楼2012-09-07 22:29:04
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windsor2011

银虫 (小有名气)
★
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
正如2楼所说，首先，做实验你做了才知道，别人说的不一定对，只有自己做了才知道。其次，你表述的不清楚。楼主还是先试试再做结论。
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4楼2012-09-07 22:48:34
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王礼鹏

金虫 (小有名气)
★
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
你是构建表达载体并表达目的蛋白，然后测其活性吗？你是不是已经表达出目的蛋白但没有活性还是还没有做？你的表述有点模糊。
如果你想确定目的基因是否连上载体，你可以酶切鉴定或者是菌液pcr。如果是你已经表达出来了，但没有活性，那原因就可能有很多了，比如你表达的是包涵体，或是你操作中的一系列问题。你能否把你的经过说具体一点。
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5楼2012-09-08 07:53:44
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 王礼鹏 at 2012-09-08 07:53:44
你是构建表达载体并表达目的蛋白，然后测其活性吗？你是不是已经表达出目的蛋白但没有活性还是还没有做？你的表述有点模糊。
如果你想确定目的基因是否连上载体，你可以酶切鉴定或者是菌液pcr。如果是你已经表达出 ...

首先谢谢您的提醒。
主要是我还没有连上呢  因为之前的那个表达载体不合适  所以现在想换个载体，找了好久实验室就只有这个pET28a，听说这个载体本身就是个包涵体。我就是想知道如果我选用了这个载体，把目的基因连到这个载体上，我能不能测酶的活性，以及原因。
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6楼2012-09-08 08:47:03
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
★
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
有人说28a表达蛋白酶活性，猜测可能是28a在连接目的片段的时候酶切位点不好设计，容易引入载体或者外源核苷酸的缘故吧。其实表达出来的蛋白是溶解状态还是包涵体跟蛋白本身的性质以及诱导量有关。在表达前最好查阅资料，了解蛋白的性质，选择合适的载体以及宿主，比如二硫键的数量等等，就可以选择相应的宿主。祝好运！
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7楼2012-09-08 10:16:50
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chibang1220

木虫 (著名写手)
★
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
是不是那个酶在大肠里表达后无法折叠成正确的构像？
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9楼2012-09-08 18:54:29
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dehong1573

至尊木虫 (正式写手)
★
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
你表述的确实不够明白，这些楼上的已经提到过，还有就是你转的大肠杆菌是BL21吗？
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10楼2012-09-09 09:38:30
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goingabroad2楼
2012-09-07 19:06   回复  
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
gcworm8楼
2012-09-08 18:20   回复  
蛋白之家(金币+1): 谢谢参与
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