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sxxuan金虫 (著名写手)
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[求助]
请大家帮忙分析蛋白纯化的结果
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最近在做蛋白纯化，是重组蛋白，大肠杆菌诱导后超声破碎的上清，加入核酸酶去除质粒DNA，这就是需要纯化的样品。我的蛋白是类病毒蛋白颗粒，大小2500kDa，预测PI大概是10。纯化有两个目的，一是得到比较纯的目的蛋白，二是把质粒DNA去掉，因为质粒残留很影响后面的实验结果。 由于上样环只有500ul容量，所以把蛋白浓缩至1ml左右，然后更换成离子交换的A buffer（20mM Tris-HCl），再上样，洗平后以0-100%B buffer（A+2M NaCl），40min的梯度洗脱，结果如下图片1： 最大的蛋白峰就是我的目的蛋白，检测了浓度时最高的，但是其他蛋白峰也能检测到目的蛋白，只是浓度没那么高而已。 第二次参考了GE的离子交换手册，说10mM CaCl2有助于沉淀DNA，5%甘油，如果高浓度盐洗脱的话可能结合能力太强，可以降低pH值，所以buffer改成50mM Tris+10mM CaCl2+5%甘油，pH10.5，再次上样，这次的样品浓度比上次的低10倍，因为处理样品的时候10mM CaCl2好像让我的样品有白色沉淀产生。实验过程和第一次一样，结果如图2： 这次的结果和上次的类似，但好像峰型没那么好看，而且每个峰都能检测到目的蛋白，同时也没有去除质粒，请问大家，这是怎么回事，我可以怎么处理和改进呢？谢谢！  1.jpg  2.jpg |
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【答案】应助回帖
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sxxuan: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-04-27 15:58:58
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 应助指数+1, 谢谢参与 2013-04-27 17:01:22
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silicare: 金币+5, BioEPI+1, 应助指数+1, 谢谢参与 2013-04-27 17:01:22
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想要去除质粒个人建议是过GE 的mono s柱。 首先，缓冲液选择pH8.0或者8.5都可以，这样情况下核酸之类的都不会傍柱的，这样就比MONO Q效果要好，可以一劳永逸的去除核酸。 其次，B的盐1M足够了，多了反而浪费，同时盐浓度太高，拉线性时候就比较麻烦。 再次，你的线型不要以时间为准，要以多少柱体积为准，（看不到你的横坐标）线性大才有可能分得开。 最后，不要指望Q或者S一次性就能将你的蛋白和杂蛋白分得很开（至少我没遇到这样的蛋白，有兴趣可以给你看看我的Q胶图片），基本杂蛋白都会递减或者递增地和目的蛋白一起洗脱下来。只要杂蛋白有递增或者递减，就说明有分离效果的，你就要去选择，Q本身就是一个舍弃的过程，舍弃杂蛋白同时也要舍弃目的蛋白。因为你后续还要过其他柱子的。 希望能帮到你。 |
2楼2013-04-27 14:29:39
sxxuan
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送红花一朵 10楼2013-04-28 12:42:54
sxxuan
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首先谢谢你的回复。 1. 我看纯化质粒都是选8-9的pH值，这时候核酸带负电，可以挂柱。不好意思忘记说我用的是Q Sephrose XL的填料。一开始是想着核酸挂住，目的蛋白流穿，但效果不是很好，结果我等下贴上来。 2. 选用pH8.5，20mM tris，2M NaCl，0-50%B洗脱，35分钟，流速2ml/min。得到的两个峰还是能检测到目的蛋白，也会怀疑核酸和目的蛋白都同时挂柱，同时被洗脱。用1M洗脱的时候，出了峰，但我再用2M洗脱（因为一开始就配的2M洗脱液），还是会有峰出来，就会担心是不是有杂蛋白没有被洗脱下来。 3. 我会查阅Mono S的相关资料，谢谢。 4. 离子交换的下一步我打算做分子筛。另外我还有疏水的填料。因为手头就这三种填料，也不知道应该怎么做才好，目的蛋白预测是疏水性的。  3.png |
3楼2013-04-27 15:56:13
sxxuan
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4楼2013-04-27 15:58:43
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【答案】应助回帖
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sxxuan: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-04-28 12:07:15
sxxuan: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-04-28 12:07:15
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不客气哈，交流嘛。 1.我记得没错的话DNA的PI 大概是4左右，RNA 好像还低一点，同时我们蛋白用的tris缓冲体系缓冲范围是7.5-8.5，所以只要过Q的话，核酸肯定会傍柱的，所以我建议的是使用S柱，这样核酸就不会傍柱了。毕竟要纯化的是蛋白，能一次性去掉核酸当然值得考虑。（就是不知道你的蛋白会不会傍S柱） 2.线性大的意思是mono Q走线性的时候，不是直线的，也是阶梯的形式，而且是按照B的百分比去跳跃的，所以当你的B buffer盐浓度过高的时候，阶梯跳跃的时候电导变化就相对比较大，蛋白洗脱时候分离效果就会不好。 3.可以先过疏水试试，能分离就好。分子筛可以进一步除去小分子核酸，我一般是在样品纯度很高的情况下才去过分子筛，毕竟一般来说分子筛就是最后一步纯化了。 希望能帮上。 |
5楼2013-04-28 10:40:42
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1.因为核酸带负电是很强的，所以洗脱的时候，要很高的盐浓度就可以洗下来。还是不要担心蛋白中含有很多的核酸。 2.疏水其实不一定非得是硫酸铵，只是硫酸铵效果会好一点，我用过2M的NaCl上样过，效果还不错。如果你偏爱硫酸铵的话，你直接可以在Q下来合并的样品里补加硫酸铵，没必要去更换缓冲液。倒是疏水填料比较讲究，phenyl的比较强，可能最后用水才能冲下来，达不到分离效果。butys又相对弱了很多。总之要看蛋白而定。 |
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