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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请大家帮忙分析蛋白纯化的结果
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sxxuan

金虫 (著名写手)

[求助] 请大家帮忙分析蛋白纯化的结果

最近在做蛋白纯化，是重组蛋白，大肠杆菌诱导后超声破碎的上清，加入核酸酶去除质粒DNA，这就是需要纯化的样品。我的蛋白是类病毒蛋白颗粒，大小2500kDa，预测PI大概是10。纯化有两个目的，一是得到比较纯的目的蛋白，二是把质粒DNA去掉，因为质粒残留很影响后面的实验结果。
由于上样环只有500ul容量，所以把蛋白浓缩至1ml左右，然后更换成离子交换的A buffer（20mM Tris-HCl），再上样，洗平后以0-100%B buffer（A+2M NaCl），40min的梯度洗脱，结果如下图片1：
最大的蛋白峰就是我的目的蛋白，检测了浓度时最高的，但是其他蛋白峰也能检测到目的蛋白，只是浓度没那么高而已。
第二次参考了GE的离子交换手册，说10mM CaCl2有助于沉淀DNA，5%甘油，如果高浓度盐洗脱的话可能结合能力太强，可以降低pH值，所以buffer改成50mM Tris+10mM CaCl2+5%甘油，pH10.5，再次上样，这次的样品浓度比上次的低10倍，因为处理样品的时候10mM CaCl2好像让我的样品有白色沉淀产生。实验过程和第一次一样，结果如图2：
这次的结果和上次的类似，但好像峰型没那么好看，而且每个峰都能检测到目的蛋白，同时也没有去除质粒，请问大家，这是怎么回事，我可以怎么处理和改进呢？谢谢！

1.jpg



2.jpg
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你的日子如何，你的力量也必如何！
1楼 2013-04-27 12:13:36
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回帖置顶 ( 共有1个 )

dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sxxuan: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-04-27 15:58:58
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 应助指数+1, 谢谢参与 2013-04-27 17:01:22
想要去除质粒个人建议是过GE 的mono s柱。
首先，缓冲液选择pH8.0或者8.5都可以，这样情况下核酸之类的都不会傍柱的，这样就比MONO Q效果要好，可以一劳永逸的去除核酸。
其次，B的盐1M足够了，多了反而浪费，同时盐浓度太高，拉线性时候就比较麻烦。
再次，你的线型不要以时间为准，要以多少柱体积为准，（看不到你的横坐标）线性大才有可能分得开。
最后，不要指望Q或者S一次性就能将你的蛋白和杂蛋白分得很开（至少我没遇到这样的蛋白，有兴趣可以给你看看我的Q胶图片），基本杂蛋白都会递减或者递增地和目的蛋白一起洗脱下来。只要杂蛋白有递增或者递减，就说明有分离效果的，你就要去选择，Q本身就是一个舍弃的过程，舍弃杂蛋白同时也要舍弃目的蛋白。因为你后续还要过其他柱子的。
希望能帮到你。
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2楼2013-04-27 14:29:39
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sxxuan

金虫 (著名写手)
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引用回帖:
7楼: Originally posted by dshlove at 2013-04-28 12:20:15
1.因为核酸带负电是很强的，所以洗脱的时候，要很高的盐浓度就可以洗下来。还是不要担心蛋白中含有很多的核酸。
2.疏水其实不一定非得是硫酸铵，只是硫酸铵效果会好一点，我用过2M的NaCl上样过，效果还不错。如果 ...

惨了，是phenyl~我以前试过加甘油或者30%异丙醇洗，都很难洗脱下来。当时用的是0.5M的磷酸缓冲液+1~2M的硫酸铵。
如果用氯化钠也可以的话，那我就不用硫酸铵了，那下次我试试。这样就不用另外配试剂了。
谢谢你的回答！
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10楼2013-04-28 12:42:54
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普通回帖

sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2013-04-27 14:29:39
想要去除质粒个人建议是过GE 的mono s柱。
首先，缓冲液选择pH8.0或者8.5都可以，这样情况下核酸之类的都不会傍柱的，这样就比MONO Q效果要好，可以一劳永逸的去除核酸。
其次，B的盐1M足够了，多了反而浪费，同时 ...

首先谢谢你的回复。
1. 我看纯化质粒都是选8-9的pH值，这时候核酸带负电，可以挂柱。不好意思忘记说我用的是Q Sephrose XL的填料。一开始是想着核酸挂住，目的蛋白流穿，但效果不是很好，结果我等下贴上来。
2. 选用pH8.5，20mM tris，2M NaCl，0-50%B洗脱，35分钟，流速2ml/min。得到的两个峰还是能检测到目的蛋白，也会怀疑核酸和目的蛋白都同时挂柱，同时被洗脱。用1M洗脱的时候，出了峰，但我再用2M洗脱（因为一开始就配的2M洗脱液），还是会有峰出来，就会担心是不是有杂蛋白没有被洗脱下来。
3. 我会查阅Mono S的相关资料，谢谢。
4. 离子交换的下一步我打算做分子筛。另外我还有疏水的填料。因为手头就这三种填料，也不知道应该怎么做才好，目的蛋白预测是疏水性的。

3.png
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3楼2013-04-27 15:56:13
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2013-04-27 14:29:39
想要去除质粒个人建议是过GE 的mono s柱。
首先，缓冲液选择pH8.0或者8.5都可以，这样情况下核酸之类的都不会傍柱的，这样就比MONO Q效果要好，可以一劳永逸的去除核酸。
其次，B的盐1M足够了，多了反而浪费，同时 ...

不好意思，刚才忘记说了，是以体积为准的，但我不知道线性大是什么意思，以前没做过蛋白纯化，一切都是看GE的手册得到的信息，还有就是在论坛上搜的经验。
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4楼2013-04-27 15:58:43
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
sxxuan: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-04-28 12:07:15
引用回帖:
3楼: Originally posted by sxxuan at 2013-04-27 15:56:13
首先谢谢你的回复。
1. 我看纯化质粒都是选8-9的pH值，这时候核酸带负电，可以挂柱。不好意思忘记说我用的是Q Sephrose XL的填料。一开始是想着核酸挂住，目的蛋白流穿，但效果不是很好，结果我等下贴上来。
2.  ...

不客气哈，交流嘛。
1.我记得没错的话DNA的PI 大概是4左右，RNA 好像还低一点，同时我们蛋白用的tris缓冲体系缓冲范围是7.5-8.5，所以只要过Q的话，核酸肯定会傍柱的，所以我建议的是使用S柱，这样核酸就不会傍柱了。毕竟要纯化的是蛋白，能一次性去掉核酸当然值得考虑。（就是不知道你的蛋白会不会傍S柱）
2.线性大的意思是mono Q走线性的时候，不是直线的，也是阶梯的形式，而且是按照B的百分比去跳跃的，所以当你的B buffer盐浓度过高的时候，阶梯跳跃的时候电导变化就相对比较大，蛋白洗脱时候分离效果就会不好。
3.可以先过疏水试试，能分离就好。分子筛可以进一步除去小分子核酸，我一般是在样品纯度很高的情况下才去过分子筛，毕竟一般来说分子筛就是最后一步纯化了。
希望能帮上。
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5楼2013-04-28 10:40:42
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by dshlove at 2013-04-28 10:40:42
不客气哈，交流嘛。
1.我记得没错的话DNA的PI 大概是4左右，RNA 好像还低一点，同时我们蛋白用的tris缓冲体系缓冲范围是7.5-8.5，所以只要过Q的话，核酸肯定会傍柱的，所以我建议的是使用S柱，这样核酸就不会傍柱 ...

谢谢。
1. 我是上网搜的，DNA在4的时候只有部分带负电，在pH8左右大部分都是带负电。由于已经买了Q的填料，现在也没办法尝试了。估计老板 不会再让我尝试买S了
2. 很多人说过了离子交换后由于高盐洗脱可以直接上疏水，因为疏水是高盐挂柱低盐洗脱。但离子交换后虽然是高盐但是氯化钠，而疏水一般都是用硫酸铵，就算是高盐，也要更换缓冲液啊？
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6楼2013-04-28 12:07:04
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
sxxuan: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-04-28 12:39:29
引用回帖:
6楼: Originally posted by sxxuan at 2013-04-28 12:07:04
谢谢。
1. 我是上网搜的，DNA在4的时候只有部分带负电，在pH8左右大部分都是带负电。由于已经买了Q的填料，现在也没办法尝试了。估计老板 不会再让我尝试买S了
2. 很多人说过了离子交换后由于高盐洗脱可以直接上 ...

1.因为核酸带负电是很强的，所以洗脱的时候，要很高的盐浓度就可以洗下来。还是不要担心蛋白中含有很多的核酸。
2.疏水其实不一定非得是硫酸铵，只是硫酸铵效果会好一点，我用过2M的NaCl上样过，效果还不错。如果你偏爱硫酸铵的话，你直接可以在Q下来合并的样品里补加硫酸铵，没必要去更换缓冲液。倒是疏水填料比较讲究，phenyl的比较强，可能最后用水才能冲下来，达不到分离效果。butys又相对弱了很多。总之要看蛋白而定。
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sxxuan
7楼2013-04-28 12:20:15
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ynkuaile

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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sxxuan: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-04-28 12:39:11
离子交换过程2楼说的很好。麻烦问你一下，你的这个蛋白是类病毒颗粒，他是包裹你的质粒DNA，还是结合你的DNA？结合的话，我想超声，加核酸酶等处理应该有效，要是包裹的，核酸酶可能作用不到。再者，你过离子交换的时候为何不开260的灯呢，开了260或者256可以实时监测，也可以判断你的蛋白中是否真的含有核酸。
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8楼2013-04-28 12:28:10
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by ynkuaile at 2013-04-28 12:28:10
离子交换过程2楼说的很好。麻烦问你一下，你的这个蛋白是类病毒颗粒，他是包裹你的质粒DNA，还是结合你的DNA？结合的话，我想超声，加核酸酶等处理应该有效，要是包裹的，核酸酶可能作用不到。再者，你过离子交换的 ...

不是包裹的，也有用核酸酶处理过，但效果不是很理想，也有效果只是还没达到使用的要求而已。
我不知道可以开260灯呢？怎么开？蛋白纯化仪不是我们实验室的，只是借用别人的，他们用不到这个功能可能就没和我说。我下次再去问问
谢谢你的回答
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9楼2013-04-28 12:38:58
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