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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请大家帮忙分析蛋白纯化的结果
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sxxuan

金虫 (著名写手)

[求助] 请大家帮忙分析蛋白纯化的结果

最近在做蛋白纯化，是重组蛋白，大肠杆菌诱导后超声破碎的上清，加入核酸酶去除质粒DNA，这就是需要纯化的样品。我的蛋白是类病毒蛋白颗粒，大小2500kDa，预测PI大概是10。纯化有两个目的，一是得到比较纯的目的蛋白，二是把质粒DNA去掉，因为质粒残留很影响后面的实验结果。
由于上样环只有500ul容量，所以把蛋白浓缩至1ml左右，然后更换成离子交换的A buffer（20mM Tris-HCl），再上样，洗平后以0-100%B buffer（A+2M NaCl），40min的梯度洗脱，结果如下图片1：
最大的蛋白峰就是我的目的蛋白，检测了浓度时最高的，但是其他蛋白峰也能检测到目的蛋白，只是浓度没那么高而已。
第二次参考了GE的离子交换手册，说10mM CaCl2有助于沉淀DNA，5%甘油，如果高浓度盐洗脱的话可能结合能力太强，可以降低pH值，所以buffer改成50mM Tris+10mM CaCl2+5%甘油，pH10.5，再次上样，这次的样品浓度比上次的低10倍，因为处理样品的时候10mM CaCl2好像让我的样品有白色沉淀产生。实验过程和第一次一样，结果如图2：
这次的结果和上次的类似，但好像峰型没那么好看，而且每个峰都能检测到目的蛋白，同时也没有去除质粒，请问大家，这是怎么回事，我可以怎么处理和改进呢？谢谢！

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你的日子如何，你的力量也必如何！
1楼 2013-04-27 12:13:36
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
sxxuan: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-04-28 12:39:29
引用回帖:
6楼: Originally posted by sxxuan at 2013-04-28 12:07:04
谢谢。
1. 我是上网搜的，DNA在4的时候只有部分带负电，在pH8左右大部分都是带负电。由于已经买了Q的填料，现在也没办法尝试了。估计老板 不会再让我尝试买S了
2. 很多人说过了离子交换后由于高盐洗脱可以直接上 ...

1.因为核酸带负电是很强的，所以洗脱的时候，要很高的盐浓度就可以洗下来。还是不要担心蛋白中含有很多的核酸。
2.疏水其实不一定非得是硫酸铵，只是硫酸铵效果会好一点，我用过2M的NaCl上样过，效果还不错。如果你偏爱硫酸铵的话，你直接可以在Q下来合并的样品里补加硫酸铵，没必要去更换缓冲液。倒是疏水填料比较讲究，phenyl的比较强，可能最后用水才能冲下来，达不到分离效果。butys又相对弱了很多。总之要看蛋白而定。
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sxxuan
7楼2013-04-28 12:20:15
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sxxuan: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-04-27 15:58:58
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 应助指数+1, 谢谢参与 2013-04-27 17:01:22
想要去除质粒个人建议是过GE 的mono s柱。
首先，缓冲液选择pH8.0或者8.5都可以，这样情况下核酸之类的都不会傍柱的，这样就比MONO Q效果要好，可以一劳永逸的去除核酸。
其次，B的盐1M足够了，多了反而浪费，同时盐浓度太高，拉线性时候就比较麻烦。
再次，你的线型不要以时间为准，要以多少柱体积为准，（看不到你的横坐标）线性大才有可能分得开。
最后，不要指望Q或者S一次性就能将你的蛋白和杂蛋白分得很开（至少我没遇到这样的蛋白，有兴趣可以给你看看我的Q胶图片），基本杂蛋白都会递减或者递增地和目的蛋白一起洗脱下来。只要杂蛋白有递增或者递减，就说明有分离效果的，你就要去选择，Q本身就是一个舍弃的过程，舍弃杂蛋白同时也要舍弃目的蛋白。因为你后续还要过其他柱子的。
希望能帮到你。
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2楼2013-04-27 14:29:39
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2013-04-27 14:29:39
想要去除质粒个人建议是过GE 的mono s柱。
首先，缓冲液选择pH8.0或者8.5都可以，这样情况下核酸之类的都不会傍柱的，这样就比MONO Q效果要好，可以一劳永逸的去除核酸。
其次，B的盐1M足够了，多了反而浪费，同时 ...

首先谢谢你的回复。
1. 我看纯化质粒都是选8-9的pH值，这时候核酸带负电，可以挂柱。不好意思忘记说我用的是Q Sephrose XL的填料。一开始是想着核酸挂住，目的蛋白流穿，但效果不是很好，结果我等下贴上来。
2. 选用pH8.5，20mM tris，2M NaCl，0-50%B洗脱，35分钟，流速2ml/min。得到的两个峰还是能检测到目的蛋白，也会怀疑核酸和目的蛋白都同时挂柱，同时被洗脱。用1M洗脱的时候，出了峰，但我再用2M洗脱（因为一开始就配的2M洗脱液），还是会有峰出来，就会担心是不是有杂蛋白没有被洗脱下来。
3. 我会查阅Mono S的相关资料，谢谢。
4. 离子交换的下一步我打算做分子筛。另外我还有疏水的填料。因为手头就这三种填料，也不知道应该怎么做才好，目的蛋白预测是疏水性的。

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3楼2013-04-27 15:56:13
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sxxuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2013-04-27 14:29:39
想要去除质粒个人建议是过GE 的mono s柱。
首先，缓冲液选择pH8.0或者8.5都可以，这样情况下核酸之类的都不会傍柱的，这样就比MONO Q效果要好，可以一劳永逸的去除核酸。
其次，B的盐1M足够了，多了反而浪费，同时 ...

不好意思，刚才忘记说了，是以体积为准的，但我不知道线性大是什么意思，以前没做过蛋白纯化，一切都是看GE的手册得到的信息，还有就是在论坛上搜的经验。
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4楼2013-04-27 15:58:43
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